Калькулятор концентрации белка | A280 в мг/мл

Калькулятор концентрации белка

Калькулятор концентрации белка преобразует показание оптической плотности, полученное на спектрофотометре, в количество белка, растворённого в растворе. Результат обычно выражают в миллиграммах на миллилитр (мг/мл) или микрограммах на миллилитр (мкг/мл). Расчёт основан на законе Бугера—Ламберта—Бера — химической зависимости, связывающей количество света, поглощённого образцом, с содержанием в нём вещества.

Как измеряют концентрацию белка

Большинство белков интенсивно поглощает ультрафиолетовый свет на длине волны 280 нанометров (нм). Это поглощение главным образом обусловлено двумя аминокислотами — триптофаном и тирозином, входящими в структуру белка. Спектрофотометр пропускает свет через образец и измеряет, какая его часть поглощается образцом. Это показание называют оптической плотностью, или A280, если измерение выполнено при 280 нм.

Измерение оптической плотности при 280 нм выполняется быстро и не разрушает образец. Этим данный метод отличается от химических методов, таких как анализы Bradford и BCA, описанные ниже. Метод лучше всего работает с очищенным белком в растворе при показании оптической плотности примерно от 0,1 до 1,0. Показания за пределами этого диапазона менее надёжны, поэтому перед измерением образец часто приходится разбавлять.

Формула концентрации белка

Калькулятор преобразует закон Бугера—Ламберта—Бера, чтобы вычислить концентрацию:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — концентрация белка в мг/мл
• A — оптическая плотность при 280 нм (безразмерное число)
• DF — коэффициент разбавления, то есть во сколько раз исходный образец был разбавлен перед измерением
• ε — коэффициент экстинкции, константа, характерная для данного белка, в л/(г·см)
• l — длина оптического пути, расстояние, которое свет проходит через образец, в см (обычно 1 см в стандартной кювете — небольшой стеклянной или пластиковой ёмкости, используемой в спектрофотометре)

Чтобы перевести результат в микрограммы на миллилитр, значение в мг/мл умножают на 1 000. Чтобы определить общую массу белка в образце, концентрацию умножают на объём образца в миллилитрах.

Пример расчёта

Оптическая плотность образца при 280 нм равна 0,5. Образец не разбавляли, поэтому коэффициент разбавления равен 1; измерение проводили в стандартной кювете размером 1 см. Белок представляет собой бычий сывороточный альбумин (BSA) с коэффициентом экстинкции 0,667 л/(g·см).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 мг/мл

В образце объёмом 1 мл это составляет примерно 0,75 мг общего белка, или 750 мкг/мл.

Коэффициенты экстинкции распространённых белков

Каждый белок по-разному поглощает свет, поскольку содержит разное количество остатков триптофана и тирозина. Коэффициент экстинкции характеризует это поглощение для конкретного белка при длине волны 280 нм и выражается в л/(г·см). Часто используют следующие значения:

Калькулятор также может использовать заданный пользователем коэффициент экстинкции для белка, отсутствующего в этом списке. Для белка с известной аминокислотной последовательностью это значение можно оценить по формуле, опубликованной Gill и von Hippel в 1989: ε₂₈₀ = (остатки триптофана × 5 500) + (остатки тирозина × 1 490) + (остатки цистина × 125). Эта формула даёт результат в единицах М⁻¹·см⁻¹ — молярных единицах, отличающихся от приведённых выше значений, выраженных в массовых единицах л/(г·см). Бесплатные инструменты, такие как ProtParam, размещённый на сервере ExPASy, вычисляют это значение непосредственно по последовательности белка.

Длина оптического пути и коэффициент разбавления

Длина оптического пути — это расстояние, которое свет проходит через образец в кювете; оно измеряется в сантиметрах. Стандартные кюветы имеют ширину 1 см. В микропробовых спектрофотометрах, измеряющих очень малые объёмы образцов, может использоваться значительно меньшая длина пути, например 0,1 см.

Коэффициент разбавления учитывает любое разбавление, выполненное перед измерением. Если оптическая плотность концентрированного образца превышала бы 1,0, его обычно сначала разбавляют буфером. Коэффициент разбавления равен общему объёму разбавленного образца, делённому на объём исходного образца. Например, смешивание 10 мкл образца с 990 мкл буфера даёт общий объём 1 000 мкл и коэффициент разбавления 100.

Другие способы измерения концентрации белка

Измерение оптической плотности при 280 нм — один из нескольких распространённых лабораторных методов.

• Анализ Bradford: использует краситель, меняющий цвет при связывании с белком. Метод хорошо подходит для неочищенных образцов, но изменение цвета может различаться у разных белков.
• Анализ BCA: основан на изменении цвета, вызванном пептидными связями белка. Он совместим со многими детергентами, но выполняется дольше, чем прямое измерение оптической плотности.
• Метод Lowry: более старый и очень чувствительный метод, который плохо взаимодействует с некоторыми распространёнными компонентами буферов.

Все эти три метода разрушают образец. Прямое измерение A280 — нет, поэтому тот же образец можно сохранить и использовать повторно.

Часто задаваемые вопросы

Каков оптимальный диапазон оптической плотности для этого метода?

От 0,1 до 1,0. Ниже 0,1 показание неточно. Выше 1,0 зависимость между оптической плотностью и концентрацией может перестать быть линейной, поэтому образец сначала следует разбавить.

Почему измеряют при 280 нм, а не при 260 нм?

Нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, интенсивно поглощают свет при 260 нм. Белки сильнее поглощают свет при 280 нм благодаря содержанию триптофана и тирозина. Измерение при 280 нм уменьшает влияние нуклеиновых кислот, присутствующих в образце.

Как определить коэффициент экстинкции белка, отсутствующего в списке?

Для белка с известной последовательностью такой инструмент, как ProtParam, рассчитывает коэффициент по количеству остатков триптофана, тирозина и цистина. Коэффициент также можно измерить напрямую, сравнив оптическую плотность образца с раствором известной концентрации.

Работает ли этот метод для смеси белков?

Лучше всего он подходит для одного очищенного белка с известным коэффициентом экстинкции. Смесь белков неизвестного состава, например клеточный лизат, обычно измеряют с помощью анализа Bradford или BCA, поскольку эти методы дают более согласованную оценку общего содержания белка.

Могут ли детергенты влиять на показания?

Да. Многие детергенты поглощают свет вблизи 280 нм, что может искажать результат. Использование холостого образца с такой же концентрацией детергента помогает вычесть фоновую оптическую плотность. При очень высокой концентрации детергента может потребоваться совместимый с детергентами анализ, например BCA.