Kalkulačka rozpustnosti proteínov - Bezplatný nástroj pre pH a teplotu

Kalkulačka rozpustnosti bielkovín odhaduje najvyššiu koncentráciu bielkoviny, ktorá zostane rozpustená v rozpúšťadle pri danom pH, teplote a iónovej sile. Základnú chémiu prevádza na jedno číslo vyjadrené v miligramoch bielkoviny na mililiter rozpúšťadla.

Rozpustnosť bielkovín je dôležitá v biochémii, pri formulácii liekov a v potravinárstve. Bielkovina, ktorá nezostane rozpustená, vytvára agregáty alebo sa vyzráža, čo môže znehodnotiť experiment alebo znemožniť injekčné podanie lieku.

Ako vypočítať rozpustnosť bielkovín

Rozpustnosť závisí od piatich faktorov: izoelektrického bodu bielkoviny (pH, pri ktorom je jej výsledný náboj nulový), teploty topenia (teplota, pri ktorej sa začína rozvíjať), dielektrickej konštanty rozpúšťadla (miera toho, ako dobre oddeľuje nabité častice), pH roztoku a iónovej sily (miera množstva rozpustenej soli).

Kalkulačka vychádza zo známej rozpustnosti každej bielkoviny vo vode pri referenčných podmienkach: 25 °C, pH 7,0 a iónovej sile 0,15 M (približne koncentrácia soli v krvi). Túto referenčnú hodnotu potom násobí štyrmi pomermi, po jednom pre každú zmenenú podmienku.

Vzorec rozpustnosti bielkovín

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ je známa rozpustnosť bielkoviny vo vode pri referenčných podmienkach v mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, kde $pI$ je izoelektrický bod bielkoviny. Rozpustnosť je najnižšia v izoelektrickom bode a rastie so vzďaľovaním pH od tejto hodnoty; v priebehu niekoľkých jednotiek pH sa ustáli.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, kde $I$ je iónová sila v móloch na liter. Pri nízkej koncentrácii soli tento člen rozpustnosť mierne zvyšuje („vysolovanie do roztoku“). Pri vysokej koncentrácii soli ju znižuje („vysolovanie z roztoku“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, kde $T_m$ je teplota topenia bielkoviny v °C. Rozpustnosť s teplotou mierne rastie, potom prudko klesá, keď sa teplota priblíži k $T_m$ a bielkovina sa začne rozvíjať.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, kde $\varepsilon$ je dielektrická konštanta rozpúšťadla. Voda má dielektrickú konštantu 78,4, takže tento člen sa vo vode rovná 1. Rozpúšťadlá, ktoré oddeľujú náboje menej účinne než voda, napríklad etanol, rozpustnosť znižujú.

Referenčné hodnoty používané kalkulačkou

Kategórie rozpustnosti

Príklad: albumín vo fosfátovom pufri

Zistite rozpustnosť albumínu vo fosfátovom pufri pri 25 °C, pH 7,4 a iónovej sile 0,15 M.

Referenčné hodnoty albumínu sú $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml a $T_m = 63°C$. Fosfátový pufor má dielektrickú konštantu 76,0.

1. Člen pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Pomer: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Iónový člen: iónová sila (0,15 M) sa rovná referenčnej hodnote, takže pomer je 1.
3. Teplotný člen: teplota (25 °C) sa rovná referenčnej hodnote, takže pomer je 1.
4. Člen rozpúšťadla: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Kalkulačka uvádza hodnotu 492,12 mg/ml, ktorá patrí do kategórie „veľmi rozpustné“.

Príklad: lyzozým v glycerole pri nízkej teplote

Zistite rozpustnosť lyzozýmu v glycerolovom roztoku pri 4 °C, pH 5,0 a iónovej sile 0,1 M. Ide o podmienky podobné skladovaniu enzýmu v chlade.

Referenčné hodnoty lyzozýmu sú $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml a $T_m = 72°C$. Glycerol má dielektrickú konštantu 42,5.

1. Člen pH: zmena z pH 7,0 na pH 5,0 (obe hodnoty sú výrazne nižšie než pI 11,35) mení člen pH len nepatrne. Pomer: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Iónový člen: zníženie iónovej sily z 0,15 M na 0,1 M mierne zvyšuje rozpustnosť účinkom vysolovania do roztoku. Pomer: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Teplotný člen: ochladenie z 25 °C na 4 °C, teda výrazne pod teplotu topenia, tento člen znižuje. Pomer: 0,8106 USD$.
4. Člen rozpúšťadla: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Kalkulačka uvádza hodnotu 35,88 mg/ml, ktorá patrí do kategórie „rozpustné“. Výsledok z referenčnej hodnoty znižuje nízka dielektrická konštanta glycerolu, nie nízka teplota.

Ako používať kalkulačku rozpustnosti bielkovín

1. Vyberte bielkovinu zo zoznamu: albumín, inzulín, lyzozým, hemoglobín, myoglobín, kolagén, kazeín alebo fibrinogén.
2. Vyberte rozpúšťadlo: voda, fosfátový pufor, trisový pufor, glycerol, DMSO, metanol, etanol alebo acetón.
3. Zadajte teplotu v °C (0 až 100), pH (0 až 14) a iónovú silu v molárnych jednotkách (0 až 2).
4. Prečítajte si vypočítanú rozpustnosť v mg/ml a jej kategóriu. Pruh pod výsledkom zobrazuje hodnotu na stupnici od 0 do 100 mg/ml a pri hodnote 100 mg/ml alebo vyššej sa úplne vyplní.

Čo ovplyvňuje rozpustnosť bielkovín

pH a izoelektrický bod. Každá bielkovina má izoelektrický bod, teda pH, pri ktorom jej povrch nenesie žiadny výsledný elektrický náboj. Pri tomto pH sa molekuly bielkoviny navzájom neodpudzujú, takže sa zhlukujú a ľahšie vypadávajú z roztoku. Zmena pH smerom od izoelektrického bodu, v ktoromkoľvek smere, dodá bielkovine výsledný náboj. Nabité molekuly sa navzájom odpudzujú, čo ich udržiava oddelené a rozpustené.

Iónová sila. Rozpustené ióny soli obklopujú nabité skupiny na povrchu bielkoviny. Pri nízkych až stredných koncentráciách tieto ióny tienia náboje, ktoré by inak priťahovali dve molekuly bielkoviny k sebe, a tým zvyšujú rozpustnosť. Tento jav sa nazýva vysolovanie do roztoku. Pri vysokých koncentráciách soli ióny súťažia s bielkovinou o molekuly vody a odoberajú vrstvu vody, ktorá udržiava bielkovinu rozpustenú. Tento jav sa nazýva vysolovanie z roztoku a tvorí základ bežnej metódy čistenia, pri ktorej sa na vyzrážanie bielkovín zo zmesi používa síran amónny.

Teplota. Zahrievanie roztoku vo všeobecnosti zvyšuje rozpustnosť, až po určitú hranicu. Keď sa teplota priblíži k teplote topenia bielkoviny, bielkovina sa začne rozvíjať. Rozvinutie odhalí hydrofóbne (vodu odpudzujúce) časti bielkoviny, ktoré sú za bežných okolností skryté v jej zloženej štruktúre. Tieto odhalené časti sa navzájom spájajú, čo spôsobuje agregáciu, takže rozpustnosť v blízkosti teploty topenia a nad ňou prudko klesá.

Rozpúšťadlo. Dielektrická konštanta rozpúšťadla vyjadruje, ako účinne oslabuje elektrickú príťažlivosť medzi nabitými časticami. Voda má vysokú dielektrickú konštantu a dobre oddeľuje náboje, preto sa väčšina bielkovín rozpúšťa vo vode lepšie než v organických rozpúšťadlách, ako sú etanol alebo acetón. Rozpúšťadlá s nízkou dielektrickou konštantou umožňujú, aby sa opačné náboje na rôznych molekulách bielkovín priťahovali silnejšie, čo podporuje agregáciu.

Obmedzenia

Kalkulačka používa zjednodušený model založený na malej skupine referenčných bielkovín a štandardných rozpúšťadiel. Nezohľadňuje čistotu bielkoviny, prísady, ako sú detergenty alebo stabilizátory, ani neobvyklé zložky pufra. Výsledky sú odhady na plánovanie experimentov, nie náhrada za priame meranie rozpustnosti v laboratóriu.

Najčastejšie otázky

Čo je rozpustnosť bielkovín? Rozpustnosť bielkovín je maximálna koncentrácia bielkoviny, ktorá zostane úplne rozpustená v rozpúšťadle bez tvorby viditeľných agregátov alebo zrazeniny.

Prečo je bielkovina najmenej rozpustná v izoelektrickom bode? V izoelektrickom bode bielkovina nemá žiadny výsledný elektrický náboj, takže molekuly bielkoviny sa už navzájom elektricky neodpudzujú. Bez tohto odpudzovania sa skôr zlepia a vypadnú z roztoku.

Aký je rozdiel medzi vysolovaním do roztoku a vysolovaním z roztoku? Vysolovanie do roztoku nastáva pri nízkych koncentráciách soli, keď rozpustené ióny tienia nabité skupiny bielkoviny pred vzájomným pôsobením a zvyšujú rozpustnosť. Vysolovanie z roztoku nastáva pri vysokých koncentráciách soli, keď ióny odoberajú vodu z povrchu bielkoviny a znižujú rozpustnosť.

Zvyšuje vyššia teplota vždy rozpustnosť? Nie. Rozpustnosť má tendenciu s teplotou rásť iba po určitú hranicu. Keď sa teplota priblíži k teplote topenia bielkoviny, bielkovina sa začne rozvíjať, čo zvyčajne spôsobí agregáciu a prudký pokles rozpustnosti.

Prečo sa bielkoviny rozpúšťajú v etanole alebo acetóne horšie než vo vode? Voda má vysokú dielektrickú konštantu, čo znamená, že veľmi účinne oslabuje elektrickú príťažlivosť medzi nabitými časťami molekúl bielkoviny. Etanol a acetón majú nižšie dielektrické konštanty, takže nabité skupiny na rôznych molekulách bielkoviny sa v týchto rozpúšťadlách priťahujú silnejšie, a agregácia je preto pravdepodobnejšia.

Aká presná je táto kalkulačka? Poskytuje odhad založený na fyzikálnom modeli a malej skupine referenčných bielkovín a rozpúšťadiel. Je užitočná na zúženie podmienok, ktoré treba otestovať, ale rozpustnosť konkrétnej vzorky bielkoviny možno potvrdiť iba experimentálnym meraním.

Ďalšie čítanie

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.