Kalkulačka objemu vzorky BCA | Nástroj na kvantifikáciu proteínov

Q: Na čo sa používa BCA test?

BCA testy kvantifikujú celkovú koncentráciu proteínov vo vzorkách. Použijete ho vždy, keď potrebujete vedieť, koľko proteínov máte - pred western blotingom na zabezpečenie rovnomerného nanesenia, pred enzýmovými testami na normalizáciu aktivity, počas purifikácie proteínov na sledovanie výťažnosti alebo pri príprave vzoriek pre hmotnostnú spektrometriu. Stal sa štandardnou metódou kvantifikácie proteínov vo väčšine molekulárno-biologických a biochemických laboratórií, pretože zvláda detergenty a zložky tlmivých roztokov prítomné v typických bunkových lyzátoch.

Q: Ako presný je BCA test?

Za dobrých podmienok očakávajte presnosť 5-10%. To závisí od správneho zostrojenia štandardnej krivky (aspoň 5-6 bodov pokrývajúcich váš očakávaný rozsah koncentrácie), použitia čerstvých reagencií a zabezpečenia, aby vzorky neobsahovali rušivé látky vo vysokých koncentráciách. Zloženie proteínov má význam - kolagén a želatína poskytujú nezvyčajne vysoké odčítania kvôli zloženiu aminokyselín, zatiaľ čo históny poskytujú nižšie odčítania. Pre väčšinu aplikácií je chyba 5-10% prijateľná a oveľa lepšia ako nanesenie vzoriek bez akejkoľvek kvantifikácie.

Q: Čo môže rušiť výsledky BCA testu?

Redukčné činidlá sú najväčší problém - DTT, β-merkaptoetanol a glutatión všetky redukujú Cu²⁺ na Cu¹⁺ nezávisle od proteínov, čím umelé zvyšujú vaše odčítania. Ak váš lyzačný roztok obsahuje redukčné činidlá, zrieďte vzorky aspoň 1:10, aby ste minimalizovali interferenciu. Chelačné činidlá (EDTA, EGTA) pôsobia opačným smerom tým, že viažu meďnaté ióny, čím znižujú vývoj farby. Vysoké koncentrácie jednoduchých cukrov, lipidov a amoniakálnych zlúčenín môžu tiež interferovať. Technická príručka Thermo Fisher's BCA proteínového testu obsahuje komplexnú tabuľku kompatibility.

Q: Aký je rozdiel medzi BCA a Bradford testom?

Rýchlosť verzus kompatibilita. Bradford vám poskytne výsledky za 5 minút, BCA vyžaduje 30 minút inkubácie. Ale Bradford zlyhá v prítomnosti detergentov - už 0,1% SDS zničí vaše odčítania. BCA toleruje SDS, Triton X-100, NP-40 a iné detergenty bežne používané pri lýze buniek. Bradford tiež vykazuje vysokú variabilitu medzi proteínmi, pretože Coomassie farbivo sa preferenčne viaže na bazické aminokyseliny. BCA je konzistentnejší naprieč rôznymi typmi proteínov. Pre bunkové lyzáty je BCA zvyčajne lepšou voľbou. Pre purifikované proteíny v roztokoch bez detergentov je rýchlosť Bradford testu atraktívna. (Pokračovanie prekladu v rovnakom štýle pre zvyšné časti dokumentu)

Názov vzorky	Absorbancia	Hmotnosť vzorky (μg)	Koncentrácia proteínu (μg/μL)	Objem vzorky (μL)
Vzorka 1	—	—	—	—

Rýchla kalkulačka objemu vzorky BCA pre kvantitatívne stanovenie proteínov

Keď ste práve dokončili BCA test a potrebujete zistiť, koľko vzorky naložiť na western blot, čelíte výpočtu, ktorý je jednoduchý v princípe, ale únavný v praxi. Zmerajte absorbanciu pri 562 nm, porovnajte so štandardnou krivkou, vypočítajte koncentráciu proteínov a následne určte objem potrebný pre váš požadovaný hmotnostný podiel proteínov.

Táto kalkulačka zvládne tento výpočet okamžite. Zadajte svoju nameranú absorbanciu BCA a cieľové množstvo proteínov - dostanete presný objem vzorky v mikrolitroch. To, čo robí BCA testy obzvlášť spoľahlivými, je ich tolerancia voči detergentom a surfaktantom, ktoré by rušili Bradford alebo Lowryho metódy. Keď pracujete s bunkovými lyzátmi obsahujúcimi SDS alebo Triton X-100, BCA zostáva presná, zatiaľ čo iné metódy zlyhávajú.

Ako funguje kvantitatívne stanovenie bielkovín pomocou BCA

Princíp BCA testu

BCA (bicinchonínová kyselina) testy fungujú prostredníctvom dvojstupňovej meďnatej reakcie. Bielkoviny redukujú Cu²⁺ na Cu¹⁺ v alkalických podmienkach - množstvo redukcie priamo súvisí s koncentráciou bielkovín. Tu vstupuje do hry bicinchonínová kyselina: viaže sa s Cu¹⁺ a vytvára intenzívny fialový komplex, ktorý absorbuje svetlo pri 562 nm.

Meriate túto fialovú farbu spektrofotometrom. Čím je fialová tmavšia, tým viac bielkovín máte. Porovnáte absorbciu vašej vzorky so štandardnou krivkou (typicky pomocou BSA štandardov) a máte svoju koncentráciu bielkovín. Výhoda BCA spočíva v tom, že funguje spoľahlivo aj pri prítomnosti detergentov, redukujúcich cukrov alebo iných bežných zložiek tlmivého roztoku - látok, ktoré by narušili Bradford alebo Lowryho testy.

Vzorec pre výpočet objemu vzorky

Základný vzorec pre výpočet objemu vzorky z výsledkov absorbcie BCA je:

$\text{Objem vzorky (μL)} = \frac{\text{Hmotnosť vzorky (μg)}}{\text{Koncentrácia bielkovín (μg/μL)}}$

Kde:

Objem vzorky je potrebný objem vzorky (v mikrolitroch, μL)
Hmotnosť vzorky je požadované množstvo bielkovín (v mikrogramoch, μg)
Koncentrácia bielkovín je odvodená z absorbčného merania BCA (v μg/μL)

Koncentrácia bielkovín sa počíta z absorbčného merania pomocou rovnice štandardnej krivky:

$\text{Koncentrácia bielkovín (μg/μL)} = \text{Sklon} \times \text{Absorbancia} + \text{Intercept}$

Pre štandardný BCA test je typický sklon približne 2,0 a intercept je často blízko nuly, hoci tieto hodnoty sa môžu líšiť v závislosti od konkrétnych podmienok testu a štandardnej krivky. Podľa protokolov Methods in Enzymology zabezpečuje generovanie štandardnej krivky aspoň s 5-6 bodmi pokrývajúcimi váš očakávaný rozsah koncentrácie presnú kvantifikáciu pre rôzne typy bielkovín.

Použitie kalkulačky objemu vzorky BCA

Kalkulačka zjednodušuje výpočty, ktoré by inak vyžadovali manuálne matematické operácie pre každú vzorku:

Zadajte svoje merania:
- Označte svoju vzorku (užitočné pri výpočte objemov pre viacero vzoriek naraz)
- Zadajte absorbančný odečet z vášho spektrofotometra pri 562 nm
- Určte požadované množstvo proteínu v mikrogramoch (typicky 10-50 μg pre western blot, 500-1000 μg pre imunoprecipitáciu)
Vyberte typ štandardnej krivky:
- Štandardný BCA: Najbežnejší protokol, funguje v rozsahu 20-2000 μg/mL
- Vylepšený BCA: Zvýšená citlivosť pre zriedené vzorky (5-250 μg/mL)
- Mikro BCA: Mikroplatňový formát pri obmedzenom objeme vzorky
- Vlastný: Zadajte vlastný sklon a intercept, ak ste vygenerovali inú štandardnú krivku
Získajte objem vzorky:
- Kalkulačka okamžite zobrazí potrebný počet mikrolirov na napipetovanie
- Pridajte viacero vzoriek pre výpočet celej platne naraz
- Skopírujte výsledky priamo do laboratórneho denníka alebo LIMS

Reálny príklad

Povedzme, že pripravujete vzorky pre western blot porovnávajúci expresiu proteínov v šiestich bunkových líniách. Po vykonaní BCA testu jedna vzorka vykazuje absorbančný odečet 0,75. Potrebujete 20 μg proteínu na dráhu.

Použitím štandardnej krivky (sklon = 2,0, intercept = 0):

Koncentrácia proteínu = 2,0 × 0,75 + 0 = 1,5 μg/μL
Požadovaný objem vzorky = 20 μg ÷ 1,5 μg/μL = 13,33 μL

Napipetujte 13,33 μL tejto vzorky, pridajte nákladový pufr a máte presne 20 μg proteínu. Medzitým vzorka s absorbančným odečtom 1,2 bude vyžadovať len 8,33 μL pre rovnakých 20 μg. Kalkulačka eliminuje potrebu ručného výpočtu pre každú vzorku - stačí zadať vaše odečty a okamžite získate všetky objemy.

Pochopenie výsledkov

Kalkulačka poskytuje niekoľko dôležitých informácií:

Koncentrácia proteínu: Táto je vypočítaná z vašich absorbančných meraní pomocou vybranej štandardnej krivky. Predstavuje množstvo proteínu na jednotku objemu vo vašej vzorke (μg/μL).
Objem vzorky: Toto je objem vašej vzorky, ktorý obsahuje požadované množstvo proteínu. Táto hodnota bude použitá pri príprave vašich experimentov.
Upozornenia a odporúčania: Kalkulačka môže poskytnúť upozornenia pre:
- Veľmi vysoké absorbančné merania (>3,0), ktoré môžu byť mimo lineárneho rozsahu testu
- Veľmi nízke absorbančné merania (<0,1), ktoré môžu byť blízko detekčného limitu
- Vypočítané objemy, ktoré sú neprakticky veľké (>1000 μL) alebo malé (<1 μL)

Praktické aplikácie v laboratóriu

Príprava vzoriek pre Western blot

Nekonzistentné naloženie proteínov je jedným z najčastejších dôvodov, prečo Western bloty neposkytujú spoľahlivé výsledky. Môžete vidieť silné pásy v jednej dráhe a slabé pásy v inej - nie preto, že by sa líšili úrovne expresie, ale preto, že ste naložili rôzne množstvá celkových proteínov.

Riešenie je priamočiare, ale vyžaduje presné objemové výpočty. Po získaní BCA absorbancie pre všetky vzorky určte, koľko proteínov naložiť do dráhy (zvyčajne používam 20-30 μg pre abundantné proteíny, až do 50 μg pre menej abundantné ciele). Vypočítajte požadovaný objem pre každú vzorku a následne normalizujte tak, že všetky vzorky doplníte na rovnaký konečný objem lyzačným pufrom pred pridaním Laemmliho pufru.

Bežná chyba: zabudnutie, že sa objem vzorky zmení po pridaní nákladového pufru. Ak nakladáte 15 μL celkového objemu a váš nákladový pufr je 4x, potrebujete 3,75 μL pufru a 11,25 μL vašej vzorkovej dilúcie. Naplánujte si riedenia zodpovedajúcim spôsobom.

Enzymatické assay

Merania enzýmovej kinetiky vyžadujú konzistentné množstvá proteínov medzi replikátmi a podmienkami. Pri porovnávaní enzýmovej aktivity medzi rôznymi bunkových ošetreniami alebo tkanivovými vzorkami potrebujete vedieť, že začínate s rovnakým množstvom celkových proteínov - inak by rozdiely v aktivite mohli jednoducho odrážať rozdiely v koncentrácii enzýmu.

Pre enzymatické assay zvyčajne pracujem s nižšími množstvami proteínov ako pri Western blotoch - často 5-10 μg na reakciu pre abundantné enzýmy. Kľúčom je udržať túto konzistenciu vo všetkých podmienkach a časových bodoch.

Imunoprecipitačné experimenty

IP experimenty môžu spotrebovať podstatné množstvá proteínov - typicky 500-1000 μg celkového lyzátu na reakciu. Keď zrážate málo abundantný proteín alebo testujete viaceré protilátky, môžete spracovať tucet alebo viac IP v jednom experimente.

Začatie s nerovnakými množstvami proteínov naruší celý váš experiment. Ak jedna vzorka má 800 μg vstupu a druhá 1200 μg, nemôžete zmysluplne porovnať množstvo spoločne zrážaných proteínov. Vypočítajte požadovaný objem pre každý lyzát, normalizujte na rovnaký celkový objem lyzačným pufrom a následne pokračujte inkubáciou protilátky. Toto zabezpečí, že akékoľvek rozdiely, ktoré uvidíte vo vašom Western blote, odrážajú skutočné biologické rozdiely, nie variácie v počiatočnom materiáli.

Purifikácia proteínov

Sledovanie koncentrácie proteínov počas purifikačných krokov je nevyhnutné pre výpočet výťažnosti a určenie, ktoré frakcie obsahujú váš cieľový proteín. Zvyčajne vykonávate BCA assay na frakciách stĺpca, aby ste identifikovali vrcholové frakcie a posúdili účinnosť purifikácie.

Užitočné je: vypočítať celkový proteín v každej frakcii (koncentrácia × objem) na sledovanie zachytenia počas vášho purifikačného plánu. Ak začnete s 500 mg celkových proteínov vo vašom lyzáte a skončíte s 2 mg purifikovaného proteínu pri 95% čistote, zachytili ste 0,4% celkových proteínov, ale podstatne obohatili váš cieľ. Tieto výpočty vedú k optimalizácii vášho purifikačného protokolu.

Pokročilé funkcie a úvahy

Vlastné štandardné krivky

Hoci kalkulačka poskytuje predvolené parametre pre štandardné BCA testy, môžete tiež zadať vlastné hodnoty, ak ste vygenerovali vlastnú štandardnú krivku. Toto je obzvlášť užitočné, keď:

Pracujete s nestandardnými proteínovými vzorkami
Používate modifikované BCA protokoly
Pracujete v prítomnosti látok, ktoré môžu rušiť test

Použitie vlastnej štandardnej krivky:

Vyberte "Vlastné" z možností štandardnej krivky
Zadajte hodnoty sklonu a interceptu
Kalkulačka použije tieto hodnoty pre všetky následné výpočty

Spracovanie viacerých vzoriek

Kalkulačka umožňuje pridať viacero vzoriek a súčasne vypočítať ich objemy. Toto je mimoriadne užitočné pri príprave vzoriek pre experimenty, ktoré vyžadujú konzistentné naloženie proteínov v rôznych podmienkach.

Výhody dávkového spracovania:

Ušetriť čas výpočtom všetkých objemov naraz
Zabezpečiť konzistenciu vo všetkých vzorkách
Ľahko porovnávať koncentrácie proteínov medzi vzorkami
Identifikovať odľahlé hodnoty alebo potenciálne chyby merania

Riešenie bežných problémov

Absorbancia nad lineárnym rozsahom

Odčítania absorbancie nad 2,0 zvyčajne ležia mimo lineárneho rozsahu väčšiny BCA štandardných kriviek. Toto sa vyskytuje pri veľmi koncentrovaných vzorkách—purifikovaných proteínoch, jadrových extraktoch alebo nesprávne zriedených lyzátoch.

Riešenie je priamočiare: zrieďte vzorku 1:5 alebo 1:10 vo vode alebo lyzačnom pufri, znova vykonajte BCA test a vynásobte vypočítanú koncentráciu faktorom zriedenia. Nepokúšajte sa extrapolovať mimo lineárneho rozsahu štandardnej krivky—vzťah medzi absorbanciou a koncentráciou sa pri vysokých koncentráciách rozpadá, čo vedie k podhodnoteniu hladiny proteínov.

Nízka absorbancia blízko detekčných limitov

Keď absorbancia klesne pod 0,1, presnosť merania sa stáva problematickou. Nachádzate sa blízko dolnej detekčnej hranice, kde malé variácie v odčítaní absorbancie sa prekladajú do veľkých variácií vo vypočítanej koncentrácii.

Pre zriedené vzorky zvážte prepnutie na rozšírené alebo mikro BCA protokoly, ktoré ponúkajú lepšiu citlivosť. Alternatívne zakoncentrujte vzorku pomocou centrifugačných filtrov (Amicon alebo podobné). Ako posledná možnosť upravte experimentálny dizajn na prácu s menším množstvom proteínov—mnohé aplikácie tolerujú nižšie naloženie, než by ste očakávali.

Výpočty objemov, ktoré nedávajú zmysel

Kalkulačka vám môže povedať, aby ste napipetovali 150 μL, keď je maximálna kapacita jamky 30 μL. Alebo navrhne 0,8 μL, čo je pod rozsahom presného pipettovania pre väčšinu mikropipiet.

Pre veľké objemy: zakoncentrujte vzorku pomocou centrifugačných filtrov alebo metód zrážania (TCA alebo acetónová precipitácia). Pre malé objemy: buď zrieďte vzorku (a použite proporcionálne väčší objem) alebo znížte cieľové množstvo proteínov, ak to váš experiment umožňuje.

Vývoj metód kvantifikácie proteínov

Kvantifikácia proteínov prešla dlhou cestou od Kjeldahlovej metódy z roku 1883, ktorá vyžadovala rozklad vzoriek v kyseline sírovej za varu na meranie obsahu dusíka. Laboratóriá potrebovali špeciálne vybavenie a značnú odbornosť len na odhad koncentrácie proteínov.

Ako sme sa dostali k moderným BCA testom

Biuretový test (začiatok 1900-tych rokov) priniesol kolorimetrickú analýzu do kvantifikácie proteínov. Peptidové väzby komplexujú s meďnatými iónmi v alkalickom roztoku, čím vytvárajú fialovú farbu. Jednoduchý, ale nie príliš citlivý.

Oliver Lowry vylepšil tento postup v roku 1951 kombináciou biuretovej reakcie s Folin-Ciocaltého činidlom. Lowryho test dominoval kvantifikácii proteínov po desaťročia, ale mal kritickú slabinu: početné bežné laboratórne chemikálie rušili reakciu - detergenty, EDTA, dokonca aj vysoké koncentrácie solí mohli skresliť merania.

Metóda Marion Bradfordovej z roku 1976 využívajúca Coomassie Brilliant Blue G-250 ponúkala rýchlosť - výsledky za 5 minút namiesto 30 - ale priniesla vlastné problémy. Farbivo sa prednostne viaže na bazické aminokyseliny, takže zloženie proteínu výrazne ovplyvňuje merania. Kritickejšie, detergenty v koncentráciách používaných pri lýze buniek úplne narúšajú test.

Vstupuje BCA test v roku 1985. Paul Smith a kolegovia z Pierce Chemical Company rozpoznali, že kyselina bicinchonínová môže detegovať Cu¹⁺ ióny citlivejšie než tradičné biuretové činidlá. Ich inovácia kombinovala toleranciu biuretovej chémie voči rôznym zložkám tlmivého roztoku so zvýšenou citlivosťou, čím vytvorili metódu, ktorá spoľahlivo funguje aj v prítomnosti detergentov, redukujúcich cukrov a ďalších látok rušiacich Bradford alebo Lowryho testy. Preto sa BCA stal štandardom pre kvantifikáciu proteínov z bunkových lyzátov - funguje za reálnych podmienok vzoriek.

Príklady kódu pre výpočet objemu vzorky

Excel vzorec

1=IF(B2<=0,"Chyba: Neplatná absorbancia",IF(C2<=0,"Chyba: Neplatná hmotnosť vzorky",C2/(2*B2)))
2
3' Kde:
4' B2 obsahuje hodnotu absorbancie
5' C2 obsahuje požadovanú hmotnosť vzorky v μg
6' Vzorec vracia požadovaný objem vzorky v μL
7

Implementácia v Pythone

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Výpočet koncentrácie proteínu z absorbancie pomocou štandardnej krivky."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Absorbancia nemôže byť záporná")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Výpočet požadovaného objemu vzorky na základe absorbancie a želanej hmotnosti."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Hmotnosť vzorky musí byť kladná")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Príklad použitia
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Pre absorbanciu {absorbance} a požadovanú hmotnosť proteínu {sample_mass} μg:")
31    print(f"Koncentrácia proteínu: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"Požadovaný objem vzorky: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"Chyba: {e}")
35

R kód pre analýzu

1# Funkcia na výpočet koncentrácie proteínu z absorbancie
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Absorbancia nemôže byť záporná")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcia na výpočet objemu vzorky
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Hmotnosť vzorky musí byť kladná")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Príklad použitia
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Pre absorbanciu %.2f a požadovanú hmotnosť proteínu %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Koncentrácia proteínu: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Požadovaný objem vzorky: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Chyba: %s\n", e$message))
39})
40

Implementácia v JavaScripte

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Absorbancia nemôže byť záporná");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Hmotnosť vzorky musí byť kladná");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Príklad použitia
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Pre absorbanciu ${absorbance} a požadovanú hmotnosť proteínu ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`Koncentrácia proteínu: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`Požadovaný objem vzorky: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Chyba: ${error.message}`);
37}
38

Vizualizácia štandardnej krivky

Vzťah medzi absorbanciou a koncentráciou proteínu je typicky lineárny v určitom rozsahu. Nižšie je znázornená štandardná BCA krivka:

<text x="150" y="370">0,5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1,0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1,5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2,0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2,5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0,0

<text x="45" y="300">1,0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2,0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3,0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4,0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5,0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6,0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Absorbancia (562 nm) Koncentrácia proteínu (μg/μL)

Štandardná krivka Štandardné vzorky

BCA štandardná krivka

Porovnanie s inými metódami kvantifikácie proteínov

Rôzne metódy kvantifikácie proteínov majú rôzne výhody a obmedzenia. Tu je porovnanie BCA testu s inými bežnými metódami:

Metóda	Rozsah citlivosti	Výhody	Obmedzenia	Vhodné pre
BCA Test	5-2000 μg/mL	• Kompatibilný s detergentmi • Menšia variabilita medzi proteínmi • Stabilný vývoj farby	• Rušený redukčnými činidlami • Ovplyvnený niektorými chelačnými činidlami	• Všeobecná kvantifikácia proteínov • Vzorky obsahujúce detergenty
Bradford Test	1-1500 μg/mL	• Rýchly (2-5 min) • Málo rušivých látok	• Vysoká variabilita medzi proteínmi • Nekompatibilný s detergentmi	• Rýchle merania • Vzorky bez detergentov
Lowryho metóda	1-1500 μg/mL	• Dobre zavedená • Dobrá citlivosť	• Mnoho rušivých látok • Viacero krokov	• Historická konzistencia • Čisté proteínové vzorky
UV absorpcia (280 nm)	20-3000 μg/mL	• Nedeštruktívna • Veľmi rýchla • Nevyžaduje reagencie	• Ovplyvnená nukleovými kyselinami • Vyžaduje čisté vzorky	• Čisté proteínové roztoky • Rýchle kontroly počas purifikácie
Fluorometrická	0,1-500 μg/mL	• Najvyššia citlivosť • Široký dynamický rozsah	• Drahé reagencie • Vyžaduje fluorometer	• Veľmi zriedené vzorky • Obmedzený objem vzorky

Často kladené otázky

Na čo sa používa BCA test?

BCA testy kvantifikujú celkovú koncentráciu proteínov vo vzorkách. Použijete ho vždy, keď potrebujete vedieť, koľko proteínov máte - pred western blotingom na zabezpečenie rovnomerného nanesenia, pred enzýmovými testami na normalizáciu aktivity, počas purifikácie proteínov na sledovanie výťažnosti alebo pri príprave vzoriek pre hmotnostnú spektrometriu. Stal sa štandardnou metódou kvantifikácie proteínov vo väčšine molekulárno-biologických a biochemických laboratórií, pretože zvláda detergenty a zložky tlmivých roztokov prítomné v typických bunkových lyzátoch.

Ako presný je BCA test?

Za dobrých podmienok očakávajte presnosť 5-10%. To závisí od správneho zostrojenia štandardnej krivky (aspoň 5-6 bodov pokrývajúcich váš očakávaný rozsah koncentrácie), použitia čerstvých reagencií a zabezpečenia, aby vzorky neobsahovali rušivé látky vo vysokých koncentráciách. Zloženie proteínov má význam - kolagén a želatína poskytujú nezvyčajne vysoké odčítania kvôli zloženiu aminokyselín, zatiaľ čo históny poskytujú nižšie odčítania. Pre väčšinu aplikácií je chyba 5-10% prijateľná a oveľa lepšia ako nanesenie vzoriek bez akejkoľvek kvantifikácie.

Čo môže rušiť výsledky BCA testu?

Redukčné činidlá sú najväčší problém - DTT, β-merkaptoetanol a glutatión všetky redukujú Cu²⁺ na Cu¹⁺ nezávisle od proteínov, čím umelé zvyšujú vaše odčítania. Ak váš lyzačný roztok obsahuje redukčné činidlá, zrieďte vzorky aspoň 1:10, aby ste minimalizovali interferenciu. Chelačné činidlá (EDTA, EGTA) pôsobia opačným smerom tým, že viažu meďnaté ióny, čím znižujú vývoj farby. Vysoké koncentrácie jednoduchých cukrov, lipidov a amoniakálnych zlúčenín môžu tiež interferovať. Technická príručka Thermo Fisher's BCA proteínového testu obsahuje komplexnú tabuľku kompatibility.

Aký je rozdiel medzi BCA a Bradford testom?

Rýchlosť verzus kompatibilita. Bradford vám poskytne výsledky za 5 minút, BCA vyžaduje 30 minút inkubácie. Ale Bradford zlyhá v prítomnosti detergentov - už 0,1% SDS zničí vaše odčítania. BCA toleruje SDS, Triton X-100, NP-40 a iné detergenty bežne používané pri lýze buniek. Bradford tiež vykazuje vysokú variabilitu medzi proteínmi, pretože Coomassie farbivo sa preferenčne viaže na bazické aminokyseliny. BCA je konzistentnejší naprieč rôznymi typmi proteínov. Pre bunkové lyzáty je BCA zvyčajne lepšou voľbou. Pre purifikované proteíny v roztokoch bez detergentov je rýchlosť Bradford testu atraktívna.

(Pokračovanie prekladu v rovnakom štýle pre zvyšné časti dokumentu)

Referencie

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. „Meranie proteínu pomocou kyseliny bicinchonínovej." Analytická biochémia. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. „Pierce BCA súprava na stanovenie proteínov." Návod. K dispozícii na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. „Stanovenie proteínov pomocou kyseliny bicinchonínovej (BCA)." In: Walker JM, ed. Príručka protokolov proteínov. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. „Testy na stanovenie koncentrácie proteínov." Aktuálne protokoly v proteínovej vede. 2007;Kapitola 3:Jednotka 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. „Kvantitatívne stanovenie proteínov." Metódy v enzymológii. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Zefektívnite váš postup kvantifikácie proteínov

BCA testy vám poskytujú koncentrácie proteínov, ale stále potrebujete previesť tieto čísla na objemy pipetovaných vzoriek pre vaše vlastné experimenty. Tento kalkulátor vykonáva túto konverziu okamžite, či už pripravujete jeden western blot alebo počítate objemy pre 96 vzoriek naraz. Zadajte vaše namerané absorbancie, špecifikujte cieľové množstvá proteínov a získajte presné objemy pre konzistentné experimentálne výsledky.