Vypočítajte presné objemy vzoriek na základe absorbčných hodnôt BCA testu a požadovanej hmotnosti proteínu. Nevyhnutné pre konzistentné zaťaženie proteínu v western blottingu a iných laboratórnych aplikáciách.
Tento nástroj vypočíta potrebný objem vzorku na základe výsledkov absorbancie BCA a hmotnosti vzorku. Zadajte hodnotu absorbancie a hmotnosť vzorku pre každý vzorok na výpočet zodpovedajúceho objemu vzorku.
Objem vzorky sa vypočíta pomocou nasledujúceho vzorca:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbancia Kalkulátor Vzorku je špecializovaný nástroj navrhnutý na pomoc výskumníkom a laboratórnym technikom presne určiť vhodný objem vzorky pre experimenty na základe výsledkov BCA (bicinchonínovej kyseliny) testu. Tento kalkulátor berie absorbancie z vášho BCA testu a požadovanú hmotnosť vzorky na výpočet presného objemu potrebného na konzistentné naloženie proteínu v aplikáciách ako je western blotting, enzymatické testy a iné techniky analýzy proteínov.
BCA test je jednou z najpoužívanejších metód na kvantifikáciu proteínov v biochemických a molekulárnych biologických laboratóriách. Meraním absorbancie vašich proteínových vzoriek a porovnaním s referenčnou krivkou môžete určiť koncentráciu proteínu s vysokou presnosťou. Náš kalkulátor zjednodušuje tento proces automatickým prevodom absorbancií na presné objemy vzoriek potrebné pre vaše experimenty.
Bicinchonínový test (BCA) je biochemický test na určenie celkovej koncentrácie proteínu v roztoku. Princíp tohto testu spočíva v tvorbe komplexu Cu²⁺-proteín za alkalických podmienok, nasledovaného redukciou Cu²⁺ na Cu¹⁺. Množstvo redukcie je úmerné prítomnému proteínu. BCA vytvára purpurovo sfarbený komplex s Cu¹⁺ v alkalickom prostredí, čím poskytuje základ na monitorovanie redukcie medi proteínmi.
Intenzita purpurovej farby sa zvyšuje úmerne s koncentráciou proteínu, čo sa dá merať pomocou spektrofotometra na približne 562 nm. Absorbancie sa potom porovnávajú s referenčnou krivkou na určenie koncentrácie proteínu v neznámych vzorkách.
Základná formula na výpočet objemu vzorky z výsledkov absorbancie BCA je:
Kde:
Koncentrácia proteínu sa vypočíta z absorbancie pomocou rovnice referenčnej krivky:
Pre štandardný BCA test je typický sklon približne 2.0 a priesečník je často blízko nuly, hoci tieto hodnoty sa môžu líšiť v závislosti od vašich konkrétnych podmienok testu a referenčnej krivky.
Náš kalkulátor zjednodušuje proces určovania objemov vzoriek z výsledkov BCA testu. Postupujte podľa týchto krokov, aby ste získali presné výpočty:
Zadajte Informácie o Vzorke:
Vyberte Typ Referenčnej Krivky:
Zobraziť Výsledky:
Kopírovať alebo Exportovať Výsledky:
Prejdime si praktický príklad:
To znamená, že by ste mali naložiť 13.33 μL vašej vzorky, aby ste získali 20 μg proteínu.
Kalkulátor poskytuje niekoľko dôležitých informácií:
Koncentrácia Proteínu: Toto je vypočítané z vašej absorbancie pomocou vybranej referenčnej krivky. Predstavuje množstvo proteínu na jednotkový objem vo vašej vzorke (μg/μL).
Objem Vzorky: Toto je objem vašej vzorky, ktorý obsahuje požadované množstvo proteínu. Táto hodnota je to, čo použijete pri príprave vašich experimentov.
Varovania a Odporúčania: Kalkulátor môže poskytnúť varovania pre:
Jednou z najbežnejších aplikácií tohto kalkulátora je príprava vzoriek pre western blotting. Konzistentné naloženie proteínu je kľúčové pre spoľahlivé výsledky western blotu, a tento kalkulátor zabezpečuje, že naložíte rovnaké množstvo proteínu pre každú vzorku, aj keď sa ich koncentrácie líšia.
Príklad pracovného postupu:
Pre enzymatické testy je často potrebné použiť konkrétne množstvo proteínu na štandardizáciu podmienok reakcie naprieč rôznymi vzorkami alebo experimentmi.
Príklad pracovného postupu:
V experimentoch s imunoprecipitáciou je dôležité začať s konzistentným množstvom proteínu na porovnanie výsledkov naprieč rôznymi podmienkami.
Príklad pracovného postupu:
Počas purifikácie proteínu je často potrebné sledovať koncentráciu proteínu a vypočítať výťažky v rôznych krokoch.
Príklad pracovného postupu:
Hoci kalkulátor poskytuje predvolené parametre pre štandardné BCA testy, môžete tiež zadať vlastné hodnoty, ak ste vytvorili vlastnú referenčnú krivku. To je obzvlášť užitočné, keď:
Ak chcete použiť vlastnú referenčnú krivku:
Kalkulátor vám umožňuje pridať viaceré vzorky a vypočítať ich objemy súčasne. To je obzvlášť užitočné pri príprave vzoriek pre experimenty, ktoré vyžadujú konzistentné naloženie proteínu naprieč rôznymi podmienkami.
Výhody dávkového spracovania:
Ak je vaša absorbancia nad 2.0, môže to byť mimo lineárneho rozsahu BCA testu. V takýchto prípadoch:
Pre absorbancie pod 0.1 môžete byť blízko detekčného limitu testu, čo môže ovplyvniť presnosť. Zvážte:
Ak kalkulátor navrhuje objem, ktorý je pre vašu aplikáciu príliš veľký:
Presná kvantifikácia proteínov bola základnou požiadavkou v biochemii a molekulárnej biologii od vzniku týchto oblastí. Ranné metódy sa spoliehali na stanovenie obsahu dusíka, čo bolo časovo náročné a vyžadovalo špecializované vybavenie.
Kjeldahlova Metóda (1883): Jedna z najskorších metód na kvantifikáciu proteínov, založená na meraní obsahu dusíka.
Biuret Test (Začiatok 1900-tych rokov): Táto metóda sa spolieha na reakciu medzi peptidovými väzbami a iónmi medi v alkalickom roztoku, čo vedie k produkcii fialovej farby.
Lowry Test (1951): Vyvinutý Oliverom Lowrym, táto metóda kombinovala biuretovu reakciu s Folin-Ciocalteu činidlom, čím sa zvýšila citlivosť.
Bradford Test (1976): Marion Bradford vyvinul túto metódu pomocou farbiva Coomassie Brilliant Blue G-250, ktoré sa viaže na proteíny a posúva maximálnu absorpciu.
BCA Test (1985): Vyvinutý Paulom Smithom a jeho kolegami v spoločnosti Pierce Chemical, táto metóda kombinovala biuretovu reakciu s detekciou BCA, ponúkajúc zlepšenú citlivosť a kompatibilitu s detergentmi.
BCA test bol prvýkrát opísaný v článku z roku 1985 Smitha a kol. s názvom "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Bol vyvinutý na riešenie obmedzení existujúcich metód, najmä interferencie rôznych chemikálií bežne používaných v extrakcii a purifikácii proteínov.
Kľúčovou inováciou bolo použitie bicinchonínovej kyseliny na detekciu Cu¹⁺ iónov produkovaných redukciou Cu²⁺ proteínom, pričom sa vytvára purpurovo sfarbený komplex, ktorý sa dá merať spektrofotometricky. To poskytlo niekoľko výhod:
Od svojho zavedenia sa BCA test stal jednou z najpoužívanejších metód kvantifikácie proteínov v biochemických a molekulárnych biologických laboratóriách po celom svete.
1=IF(B2<=0,"Chyba: Neplatná absorbancia",IF(C2<=0,"Chyba: Neplatná hmotnosť vzorky",C2/(2*B2)))
2
3' Kde:
4' B2 obsahuje absorbanciu
5' C2 obsahuje požadovanú hmotnosť vzorky v μg
6' Formula vracia požadovaný objem vzorky v μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Vypočítajte koncentráciu proteínu z absorbancie pomocou referenčnej krivky."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbancia nemôže byť záporná")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Vypočítajte požadovaný objem vzorky na základe absorbancie a požadovanej hmotnosti."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Hmotnosť vzorky musí byť kladná")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Príklad použitia
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Pre absorbanciu {absorbance} a požadovanú hmotnosť proteínu {sample_mass} μg:")
31 print(f"Koncentrácia proteínu: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Požadovaný objem vzorky: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Chyba: {e}")
351# Funkcia na výpočet koncentrácie proteínu z absorbancie
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbancia nemôže byť záporná")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcia na výpočet objemu vzorky
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Hmotnosť vzorky musí byť kladná")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Príklad použitia
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Pre absorbanciu %.2f a požadovanú hmotnosť %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Koncentrácia proteínu: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Požadovaný objem vzorky: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Chyba: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbancia nemôže byť záporná");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Hmotnosť vzorky musí byť kladná");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Vypočítaná koncentrácia proteínu musí byť kladná");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Príklad použitia
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Pre absorbanciu ${absorbance} a požadovanú hmotnosť ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Koncentrácia proteínu: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Požadovaný objem vzorky: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Chyba: ${error.message}`);
37}
38Vztah medzi absorbanciou a koncentráciou proteínu je zvyčajne lineárny v určitom rozsahu. Nižšie je vizualizácia štandardnej BCA krivky:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Rôzne metódy kvantifikácie proteínov majú rôzne výhody a obmedzenia. Tu je porovnanie BCA testu s inými bežnými metódami:
| Metóda | Rozsah Citlivosti | Výhody | Obmedzenia | Najlepšie Pre |
|---|---|---|---|---|
| BCA Test | 5-2000 μg/mL | • Kompatibilný s detergentmi • Menej variabilný medzi proteínmi • Stabilný vývoj farby | • Interferovaný redukčnými činidlami • Ovplyvnený niektorými chelatačnými činidlami | • Všeobecná kvantifikácia proteínov • Vzorky obsahujúce detergenty |
| Bradford Test | 1-1500 μg/mL | • Rýchly (2-5 min) • Málo interferujúcich látok | • Vysoká variabilita medzi proteínmi • Nezlučiteľný s detergentmi | • Rýchle merania • Vzorky bez detergentov |
| Lowry Metóda | 1-1500 μg/mL | • Dobre zavedená • Dobrá citlivosť | • Mnoho interferujúcich látok • Viacero krokov | • Historická konzistencia • Čisté proteínové vzorky |
| UV Absorbancia (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedeštruktívny • Veľmi rýchly • Žiadne činidlá potrebné | • Ovplyvnené nukleovými kyselinami • Vyžaduje čisté vzorky | • Čisté proteínové roztoky • Rýchle kontroly počas purifikácie |
| Fluorometrický | 0.1-500 μg/mL | • Najvyššia citlivosť • Široký dynamický rozsah | • Drahé činidlá • Vyžaduje fluorometer | • Veľmi riedke vzorky • Obmedzený objem vzorky |
BCA (bicinchonínová kyselina) test sa primárne používa na kvantifikáciu celkovej koncentrácie proteínu vo vzorke. Je široko používaný v biochemii, bunkovej biológii a molekulárnej biológii na aplikácie ako western blotting, enzymatické testy, imunoprecipitáciu a purifikáciu proteínov.
BCA test je zvyčajne presný v rámci 5-10% pri správnom vykonaní. Jeho presnosť závisí od niekoľkých faktorov, vrátane kvality referenčnej krivky, absencie interferujúcich látok a toho, či je zloženie neznámeho proteínu podobné proteínu použitému v referenčnej krivke.
Niekoľko látok môže interferovať s výsledkami BCA testu, vrátane:
Hlavné rozdiely sú:
Ak kalkulátor zobrazuje veľmi veľký objem vzorky, zvyčajne to naznačuje nízku koncentráciu proteínu vo vašej vzorke. Môže to byť spôsobené:
Zvážte koncentráciu vašej vzorky alebo úpravu vášho experimentálneho dizajnu na prispôsobenie nižším koncentráciám proteínu.
Tento kalkulátor je špecificky navrhnutý pre výsledky BCA testu. Hoci základný princíp (prevod koncentrácie na objem) platí aj pre iné metódy, vzťah medzi absorbanciou a koncentráciou proteínu sa líši medzi rôznymi testami. Pre iné metódy ako Bradford alebo Lowry by ste museli použiť iné parametre referenčnej krivky.
Pre absorbancie mimo lineárneho rozsahu (typicky >2.0):
Bovinný sérový albumín (BSA) je najbežnejšie používaný štandard pre BCA testy, pretože je:
Avšak, ak vaše vzorky obsahujú prevažujúci proteín, ktorý sa významne líši od BSA, zvážte použitie tohto proteínu ako vášho štandardu pre presnejšie výsledky.
Purpurová farba vyvinutá v BCA reakcii je stabilná niekoľko hodín pri izbovej teplote a môže byť meraná kedykoľvek v tomto období. Pre najlepšie výsledky sa však odporúča merať všetky štandardy a vzorky približne v rovnakom čase po vývoji farby.
Hoci je technicky možné znovu použiť referenčnú krivku, pre presnú kvantifikáciu sa to neodporúča. Variácie v činidlách, inkubačných podmienkach a kalibrácii prístroja môžu ovplyvniť vzťah medzi absorbanciou a koncentráciou proteínu. Pre spoľahlivé výsledky generujte čerstvú referenčnú krivku zakaždým, keď vykonáte test.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Pokyny. Dostupné na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Teraz, keď rozumiete princípom kvantifikácie proteínu BCA a výpočtu objemu vzorky, vyskúšajte náš kalkulátor na zjednodušenie vašej laboratórnej práce. Jednoducho zadajte vaše absorbancie a požadovanú hmotnosť vzorky, aby ste získali okamžité, presné výpočty objemu vzorky.
Či už pripravujete vzorky na western blotting, enzymatické testy alebo akýkoľvek iný experiment založený na proteíne, náš kalkulátor pomôže zabezpečiť konzistentné a spoľahlivé výsledky. Ušetrite čas, znížte chyby a zlepšite reprodukovateľnosť vašich experimentov s BCA Absorbancia Kalkulátorom Vzorku.
Objavte ďalšie nástroje, ktoré by mohli byť užitočné pre vašu pracovnú postupnosť