Kalkulačka objemu vzorky BCA | Nástroj na kvantifikáciu proteínov

Čo je kalkulačka objemu vzorky pre BCA

Kalkulačka objemu vzorky pre BCA prevádza hodnotu absorbancie z BCA testu na objem vzorky v mikrolitroch (μL), ktorý je potrebný na nanesenie požadovaného množstva bielkoviny. Používa sa po vykonaní testu bielkovín s kyselinou bicinchonínovou (BCA), bežného laboratórneho testu, ktorý meria množstvo bielkoviny v roztoku podľa množstva fialového sfarbenia, ktoré vzorka vytvorí a ktoré pohlcuje svetlo.

Ako test BCA meria bielkoviny

Test BCA prebieha v dvoch krokoch. Najprv bielkovina vo vzorke redukuje ióny medi (Cu²⁺) na inú formu (Cu¹⁺) v alkalickom roztoku. Miera redukcie závisí od množstva prítomnej bielkoviny. V druhom kroku sa kyselina bicinchonínová viaže na redukovanú meď a vytvára fialovú zlúčeninu, ktorá silno absorbuje svetlo pri vlnovej dĺžke 562 nanometrov (nm).

Spektrofotometer meria, koľko svetla vzorka absorbuje pri 562 nm. Toto číslo sa nazýva absorbancia. Tmavšie fialové sfarbenie znamená vyššiu absorbanciu a väčšie množstvo bielkoviny. Laboratórium porovnáva absorbanciu každej vzorky so štandardnou krivkou vytvorenou meraním známych koncentrácií referenčnej bielkoviny, zvyčajne hovädzieho sérového albumínu (BSA).

BCA je obľúbená metóda, pretože funguje aj vtedy, keď vzorka obsahuje detergenty, napríklad SDS alebo Triton X-100, teda chemikálie bežné v pufroch na lýzu buniek, ktoré však narúšajú dve staršie metódy, Bradfordovu a Lowryho.

Vzorec na prepočet absorbancie BCA na objem vzorky

Štandardná krivka BCA je priamka aproximovaná závislosťou absorbancie od koncentrácie:

$\text{Absorbancia} = \text{Smernica} \times \text{Koncentrácia} + \text{Absolútny člen}$

Pri opačnom postupe, teda pri prepočte nameranej absorbancie späť na koncentráciu bielkoviny, sa rovnica upraví:

$\text{Koncentrácia bielkoviny (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbancia} - \text{Absolútny člen}}{\text{Smernica}}$

Keď je koncentrácia známa, objem vzorky obsahujúci požadované množstvo bielkoviny je:

$\text{Objem vzorky (μL)} = \frac{\text{Množstvo vzorky (μg)}}{\text{Koncentrácia bielkoviny (μg/μL)}}$

Kalkulačka ponúka štyri prednastavené typy kriviek, pričom každý má vlastnú smernicu a absolútny člen. Absolútny člen je 0 pri každom prednastavení, pretože hodnoty sú korigované o slepú vzorku (najprv sa odčíta absorbancia kontroly bez bielkoviny). Smernica vyjadruje, akú časť rozsahu absorbancie platničky pokrýva pracovný rozsah daného protokolu.

Citlivejší protokol určený pre zriedené vzorky vytvára väčšiu absorbanciu na mikrogram bielkoviny, a preto má väčšiu smernicu. Vylepšená BCA a mikro-BCA sú určené pre vzorky príliš zriedené na presné meranie štandardným protokolom.

Ako vypočítať objem vzorky z absorbancie BCA

1. Vykonajte test BCA a odčítajte absorbanciu pri 562 nm pre každú vzorku.
2. Vyberte typ krivky zodpovedajúci použitému protokolu (štandardná, vylepšená alebo mikro-BCA) alebo zadajte vlastnú smernicu a absolútny člen z krivky vytvorenej v daný deň.
3. Pre každú vzorku zadajte hodnotu absorbancie a požadované množstvo bielkoviny v mikrogramoch.
4. Kalkulačka prevedie absorbanciu na koncentráciu bielkoviny a potom vydelí požadované množstvo touto koncentráciou, čím získa objem na odpipetovanie.

Príklad: Výpočet objemu vzorky z absorbancie BCA

Výskumník pripravujúci western blot potrebuje 20 μg bielkoviny na jednu dráhu a používa štandardnú krivku BCA (smernica 1,0, absolútny člen 0).

Vzorka A má absorbanciu 0,75:

• Koncentrácia bielkoviny = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Objem vzorky = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Vzorka B má absorbanciu 1,2:

• Koncentrácia bielkoviny = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Objem vzorky = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Vzorka A je zriedenejšia, takže na dosiahnutie rovnakého cieľa 20 μg je potrebný väčší objem.

Ako interpretovať výsledky kalkulačky

Kalkulačka uvádza pre každú vzorku dve čísla: koncentráciu bielkoviny v μg/μL a objem vzorky v μL. Označuje aj výsledky, ktoré pravdepodobne spôsobia problémy:

• Absorbancia nad 3,0 spustí upozornenie, pretože typické hodnoty BCA sa pohybujú medzi 0 a 2,0.
• Absorbancia pod 0,05 (ale vyššia než nula) spustí upozornenie, že výsledok môže byť menej presný, pretože slabý signál je citlivejší na merací šum.
• Vypočítaný objem 1000 μL alebo väčší spustí upozornenie, aby sa použila koncentrovanejšia vzorka.
• Vypočítaný objem menší než 0,5 μL spustí upozornenie, že objem môže byť ťažké presne odpipetovať.
• Záporná absorbancia alebo záporné množstvo vzorky sa bez ďalšieho odmietne.

Praktické využitie v laboratóriu

Konzistentné nanášanie bielkoviny je jedným z najčastejších zdrojov zlyhania pri western blote: nerovnomerná intenzita pruhov v jednotlivých dráhach často odráža nerovnaké množstvo nanesenej bielkoviny, nie skutočné rozdiely v expresii. Výpočet presného objemu pre každú vzorku na základe jej vlastnej hodnoty absorbancie udržiava rovnaké množstvo nanesenej bielkoviny v celom géli.

Rovnaký výpočet sa používa pri enzýmových testoch, kde porovnanie aktivity medzi podmienkami vyžaduje začať s rovnakým celkovým množstvom bielkoviny, aj pri imunoprecipitácii, kde nerovnaké vstupné množstvo bielkoviny (napríklad 800 μg v jednej skúmavke oproti 1200 μg v inej) sťažuje porovnávanie výsledkov. Počas purifikácie bielkovín sa rovnaký vzorec používa v každom kroku na sledovanie množstva bielkoviny, ktoré zostáva v jednotlivých frakciách.

Porovnanie s inými testami bielkovín

Stručná história kvantifikácie bielkovín

Prvé merania bielkovín využívali Kjeldahlovu metódu (1883), ktorá merala obsah dusíka po rozklade vzorky v kyseline. Biuretový test, vyvinutý na začiatku 1900-tych rokov, využíval farebnú reakciu medzi peptidovými väzbami a iónmi medi, no nebol veľmi citlivý. Oliver Lowry spojil biuretovú reakciu s ďalším činidlom v roku 1951, čím vytvoril Lowryho metódu, ktorá desaťročia dominovala meraniu bielkovín napriek tomu, že ju narúšali bežné laboratórne chemikálie, napríklad detergenty a EDTA. Marion Bradfordová predstavila rýchlejšiu metódu väzby farbiva v roku 1976, no aj tá zlyhávala v prítomnosti detergentov a jej výsledky sa líšili v závislosti od aminokyselinového zloženia bielkoviny. Paul Smith a jeho kolegovia zo spoločnosti Pierce Chemical Company publikovali metódu BCA v roku 1985. Spojili biuretovú chémiu s vyššou citlivosťou kyseliny bicinchonínovej na meď a vytvorili test tolerujúci detergenty prítomné v typických lyzátoch buniek.

Príklad kódu

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Často kladené otázky

Na čo sa používa test BCA? Meria celkovú koncentráciu bielkoviny v roztoku, najčastejšie pred nanesením rovnakého množstva bielkoviny pri wester blote, pred normalizáciou testov enzýmovej aktivity alebo pri sledovaní výťažku počas purifikácie bielkovín.

Aký presný je test BCA? Za dobrých podmienok sú výsledky zvyčajne presné s odchýlkou do 5–10%, ak má štandardná krivka aspoň päť alebo šesť bodov a vzorka neobsahuje vysokú koncentráciu interferujúcej látky.

Čo ovplyvňuje výsledky testu BCA? Redukčné činidlá vrátane DTT a β-merkaptetanolu umelo zvyšujú absorbanciu, pretože samy redukujú meď nezávisle od bielkoviny. Chelatačné činidlá, napríklad EDTA, znižujú absorbanciu väzbou medi ešte pred jej reakciou.

Aký je rozdiel medzi testami BCA a Bradford? Bradfordova metóda poskytne výsledok približne za päť minút, no detergenty ju narúšajú a výsledky sa líšia v závislosti od aminokyselinového zloženia bielkoviny. BCA trvá približne 30 minút, ale toleruje detergenty a poskytuje konzistentnejšie hodnoty pri rôznych bielkovinách, takže je vhodnejšia pre lyzáty buniek.

Prečo je vypočítaný objem vzorky nezvyčajne veľký? Veľký objem znamená, že nameraná koncentrácia bielkoviny je nižšia, než sa očakávalo. Medzi bežné príčiny patrí neúplná lýza buniek, príliš zriedená vzorka alebo hodnota absorbancie blízka dolnej hranici detekcie testu. Zahustenie vzorky pomocou centrifugačného filtra alebo prechod na vylepšený či mikro-BCA protokol tento problém zvyčajne vyrieši.

Čo treba urobiť, ak absorbancia leží mimo lineárneho rozsahu? Vzorku zrieďte a meranie zopakujte. Závislosť medzi absorbanciou a koncentráciou sa nad približne 2,0 porušuje, takže extrapolácia za štandardnú krivku podhodnotí skutočnú koncentráciu.

Zdroje

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT a kol. „Measurement of protein using bicinchoninic acid.“ Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. „Pierce BCA Protein Assay Kit“, používateľská príručka (MAN0011430).
3. Bradford MM. „A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.“ Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.