Kalkulačka koncentrácie DNA

Kalkulačka koncentrácie DNA prevádza meranie absorbancie UV žiarenia pri 260 nanometroch, označované ako A260, na koncentráciu DNA v nanogramoch na mikroliter (ng/µL). Uvádza aj celkové množstvo DNA vo vzorke v mikrogramoch (µg).

Čo je absorbancia A260?

A260 je množstvo ultrafialového žiarenia, ktoré roztok absorbuje pri vlnovej dĺžke 260 nanometrov. DNA absorbuje UV žiarenie najsilnejšie v blízkosti tejto vlnovej dĺžky v dôsledku svojich nukleotidových báz. Spektrofotometer meria A260 po meraní slepej vzorky, pri ktorom sa použitím rovnakého pufra ako vo vzorke odstráni absorbancia pozadia. Čím viac DNA roztok obsahuje, tým vyššia je nameraná hodnota A260.

Vzorec na výpočet koncentrácie DNA

Dvojvláknová DNA absorbuje UV žiarenie úmerne svojej koncentrácii; tento vzťah sa označuje ako Beerov-Lambertov zákon. Pri štandardnej dráhe svetla dlhej 1 centimeter obsahuje roztok s hodnotou A260 1,0 približne 50 ng/µL dvojvláknovej DNA. Toto číslo, konverzný faktor, prevádza každú hodnotu A260 na koncentráciu:

Koncentrácia DNA (ng/µL) = A260 × 50 × riediaci faktor

Riediaci faktor zohľadňuje každé zriedenie vykonané pred meraním vzorky. Vzorka meraná bez zriedenia má riediaci faktor 1.

Ako vypočítať celkový výťažok DNA

Po určení koncentrácie možno celkovú hmotnosť DNA vo vzorke vypočítať z jej objemu:

Celkové množstvo DNA (µg) = koncentrácia (ng/µL) × objem (µL) ÷ 1000

Ako vypočítať koncentráciu DNA: postup krok za krokom

Pred meraním vzorku dôkladne premiešajte. DNA sa môže prichytiť na steny skúmavky alebo sa nerovnomerne usadiť.
Ak je vzorka veľmi koncentrovaná, zrieďte ju tak, aby hodnota A260 bola medzi 0,1 a 1,0. Merania spektrofotometrom sú mimo tohto rozsahu najmenej spoľahlivé.
Spektrofotometer vynulujte pomocou rovnakého pufra, aký sa použil na zriedenie, a potom zmerajte vzorku pri 260 nm.
Do kalkulačky zadajte hodnotu A260, objem vzorky a riediaci faktor, aby ste získali koncentráciu a celkový výťažok. Pred zobrazením výsledku musia byť vyplnené všetky tri polia a objem musí byť väčší než nula.

Vzorový príklad

Príklad 1: nezriedená vzorka

Hodnota A260 je 0,5, vzorka nebola zriedená (riediaci faktor 1) a jej objem je 100 µL.

Koncentrácia = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Celkové množstvo DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Príklad 2: zriedená vzorka

Skúmavka obsahuje 50 µL purifikovanej DNA. Malá časť bola zriedená 10-násobne a v zriedenej časti bola nameraná hodnota A260 0,75. Riediaci faktor prepočíta túto hodnotu na koncentráciu v pôvodnej skúmavke a objem 50 µL sa zadáva pri výpočte celkového výťažku.

Koncentrácia = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Celkové množstvo DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Výpočet riediaceho faktora

Riediaci faktor = celkový objem po zriedení ÷ objem pôvodnej vzorky.

Pridaním 5 µL roztoku DNA k 45 µL pufra vznikne celkový objem 50 µL, takže riediaci faktor je 50 ÷ 5 = 10. Vzorka, ktorá nebola zriedená, má riediaci faktor 1.

Typické rozsahy koncentrácie DNA

Koncentrácia závisí od typu vzorky a metódy izolácie. Koncentrácie pri izolácii genomickej DNA sa zvyčajne pohybujú približne medzi 10 a 100 ng/µL. Pri príprave plazmidovej DNA sa často dosahujú vyššie koncentrácie, niekedy niekoľko stoviek ng/µL. Výsledok výrazne mimo očakávaného rozsahu pre danú metódu môže poukazovať na problém s izoláciou alebo samotným meraním.

Obmedzenia merania absorbancie UV žiarenia

Meranie A260 je rýchle, ale nejde o najcitlivejšiu ani najšpecifickejšiu metódu stanovenia DNA. Bielkoviny, RNA a niektoré zložky pufra tiež absorbujú žiarenie v blízkosti 260 nm a môžu zvýšiť nameranú hodnotu. Na posúdenie kontaminácie bielkovinami sa spolu s koncentráciou často kontroluje pomer A260/A280; pomer približne 1,8 zvyčajne označuje čistú vzorku DNA. Metódy založené na fluorescenčných farbivách, napríklad testy Qubit, sa viažu iba na dvojvláknovú DNA a poskytujú presnejšie meranie pri zriedených alebo nečistých vzorkách, vyžadujú však ďalšie činidlá a fluorometer.

Často kladené otázky

Ako vypočítať koncentráciu DNA z hodnoty A260?

Vynásobte hodnotu A260 číslom 50, štandardným konverzným faktorom pre dvojvláknovú DNA, a potom riediacim faktorom. Ak vzorka nebola zriedená, použite riediaci faktor 1.

Aký pomer A260/A280 je vhodný?

Pomer približne 1,8 zvyčajne označuje čistú vzorku DNA. Nižší pomer naznačuje kontamináciu bielkovinami. Pomer vyšší než 2,0 môže naznačovať kontamináciu RNA.

Možno túto kalkulačku použiť na RNA?

Nie priamo, pretože pri RNA sa namiesto 50 používa konverzný faktor 40 ng/µL. Koncentráciu RNA možno odhadnúť vynásobením výsledku kalkulačky číslom 0,8 (40 ÷ 50), prípadne priamo použiť vzorec A260 × 40 × riediaci faktor.

Prečo by mala byť hodnota A260 medzi 0,1 a 1,0?

Absorbancia zostáva približne úmerná koncentrácii, ako opisuje Beerov-Lambertov zákon, najmä v tomto rozsahu. Mimo neho sú merania menej spoľahlivé, preto treba príliš koncentrovanú alebo príliš zriedenú vzorku pred opätovným meraním zriediť alebo skoncentrovať.

Aký je rozdiel medzi koncentráciou a čistotou?

Koncentrácia vyjadruje, koľko DNA je prítomné v ng/µL. Čistota vyjadruje, nakoľko je vzorka bez nečistôt, a posudzuje sa najmä podľa pomerov absorbancie, napríklad A260/A280. Vzorka môže mať vysokú koncentráciu a zároveň byť nečistá, alebo môže mať nízku koncentráciu a byť veľmi čistá.

Ako previesť ng/µL na µg/mL?

Tieto dve jednotky majú rovnakú číselnú hodnotu. 1 ng/µL sa rovná 1 µg/mL, pretože jednotka hmotnosti aj jednotka objemu sa menia v pomere 1000.

Zdroje

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. vydanie). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Kalkulačka koncentrácie DNA | Prevod A260 na ng/μL