Kalkulator Beer-Lambertovega zakona - Trenutni izračun absorbance

Kaj je Beer-Lambertov zakon?

Beer-Lambertov zakon je formula, ki opisuje, koliko svetlobe absorbira raztopina. Absorbanco povezuje s tremi dejavniki: koncentracijo raztopine, intenzivnostjo absorpcije svetlobe v raztopljeni snovi in razdaljo, ki jo svetloba prepotuje skozi vzorec. Imenuje se tudi Beerov zakon. Kalkulator Beer-Lambertovega zakona s to formulo iz nekaj preprostih vnosov izračuna absorbanco, transmitanco in odstotek absorbirane svetlobe.

Zakon je temeljno orodje v spektroskopiji, vedi o tem, kako snov absorbira in oddaja svetlobo. Vsakodnevno se uporablja v kemijskih, bioloških in medicinskih laboratorijih za merjenje koncentracije snovi v raztopini.

Formula Beer-Lambertovega zakona

Beer-Lambertov zakon pravi:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A je absorbanca, torej količina svetlobe, ki jo raztopina absorbira pri določeni valovni dolžini. Nima enot.
• ε (epsilon) je molarni absorpcijski koeficient, imenovan tudi molarni ekstinkcijski koeficient. Meri, kako močno snov absorbira svetlobo pri določeni valovni dolžini. Enota: L/(mol·cm).
• c je koncentracija snovi v mol/L (molarnost).
• l je dolžina optične poti, torej razdalja, ki jo svetloba prepotuje skozi vzorec, v cm.

Absorbanca je povezana s transmitanco, deležem svetlobe, ki preide skozi vzorec:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

T je transmitanca, število med 0 in 1. Če T pomnožimo s 100, dobimo odstotek prepuščene svetlobe. Odstotek absorbirane svetlobe je:

$\text{Odstotek absorbirane svetlobe} = (1 - T) \times 100\%$

Na primer, absorbanca 1,0 pomeni T = 0,1, zato je bilo absorbiranih 90 % svetlobe. Absorbanca 2,0 pomeni T = 0,01, zato je bilo absorbiranih 99 % svetlobe.

Kako izračunati absorbanco

Za izračun absorbance s kalkulatorjem vnesite tri vrednosti:

1. Dolžina optične poti (l) — širina posode z vzorcem, običajno kivete. Večina standardnih kivet je široka 1 cm, nekatere specializirane pa 0,1 cm ali 10 cm.
2. Molarni absorpcijski koeficient (ε) — lastnost določene snovi pri določeni valovni dolžini. Običajno ga najdemo v objavljenih referenčnih preglednicah ali izračunamo iz strukture molekule. Beljakovine na primer absorbirajo svetlobo pri približno 280 nm zaradi dveh aminokislin, triptofana in tirozina, natančna vrednost pa je odvisna od tega, koliko teh aminokislin vsebuje beljakovina.
3. Koncentracija (c) — količina raztopljene snovi v mol/L. Koncentracije, podane v drugih enotah, kot je mg/mL, je treba najprej pretvoriti z uporabo molske mase molekule.

Kalkulator tri števila pomnoži med seboj in tako dobi absorbanco, nato pa iz tega rezultata izračuna transmitanco in odstotek absorbirane svetlobe.

Primer izračuna

Raziskovalec prečisti beljakovino in mora pred izvedbo poskusa preveriti njeno koncentracijo. Molarni absorpcijski koeficient beljakovine pri 280 nm je znan iz njenega zaporedja: ε = 44.000 L/(mol·cm). Raziskovalec vzorec izmeri v standardni kiveti z optično potjo 1 cm in odčita absorbanco A = 0,523.

Preureditev formule za izračun koncentracije:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

To je 11,9 mikromolarjev (μM). To je v območju, v katerem instrumenti merijo najnatančneje, zato lahko raziskovalec rezultatu zaupa, ne da bi moral vzorec dodatno razredčiti.

Razlaga vrednosti absorbance

• A = 0: pri tej valovni dolžini se ne absorbira nič svetlobe.
• A = 0,3 do 0,9: območje, v katerem večina spektrofotometrov zagotavlja najbolj natančne in linearne meritve.
• A = 1,0: absorbiranih je 90 % svetlobe, 10 % pa je prepuščene.
• A = 2,0: absorbiranih je 99 %, prepuščenih pa 1 % svetlobe.
• A nad 2,5: zunaj zanesljivega območja večine instrumentov. Vzorec je treba razredčiti in ponovno izmeriti.

Na meritve pod približno 0,3 vpliva šum instrumenta. Na meritve nad približno 1,5 vpliva majhna količina razpršene svetlobe v instrumentu, kar povzroča napako. Redčenje vzorca in ponovna meritev sta običajen ukrep, kadar je meritev zunaj natančnega območja.

Kje se uporablja Beer-Lambertov zakon

Analizna kemija. Laboratoriji izmerijo absorbanco vzorca in s formulo izračunajo neznano koncentracijo. To je običajno pri merjenju vsebnosti nitratov, fosfatov in kovinskih ionov v vodi ter pri preverjanju koncentracije kemijske serije med proizvodnjo.

Biokemija. Absorbanca pri 280 nm omogoča oceno koncentracije beljakovin. Absorbanca pri 260 nm omogoča oceno koncentracije DNK ali RNK; po dogovoru absorbanca 1,0 ustreza približno 50 μg/mL dvoverižne DNK ali 40 μg/mL RNK. Razmerje med meritvama (A260/A280) omogoča grobo oceno čistosti vzorca.

Farmacija. Proizvajalci zdravil uporabljajo meritve absorbance za preverjanje hitrosti sproščanja učinkovine iz tablete in za spremljanje razgradnje zdravila med shranjevanjem.

Medicina. Številni avtomatizirani analizatorji krvi merijo absorbanco pri kemijskih reakcijah, ki spreminjajo barvo, in tako določajo ravni glukoze, jetrnih encimov in bilirubina.

Hrana in pijača. Barvo piva merijo z absorbanco pri 430 nm po metodi Evropske konvencije pivovarjev (EBC). Podobne metode se uporabljajo za preverjanje barve vina in brezalkoholnih pijač.

Omejitve Beer-Lambertovega zakona

Zakon predpostavlja, da je svetloba ene same natančno določene valovne dolžine in da vzorec svetlobe ne razpršuje. V nekaterih pogostih primerih ne velja:

• Visoka koncentracija. Nad približno 0,01 mol/L začnejo raztopljene molekule medsebojno učinkovati, absorbanca pa ne narašča več linearno s koncentracijo.
• Motni vzorci ali vzorci z delci. Suspenzije in motne tekočine svetlobo poleg absorbiranja tudi razpršujejo, zato je odčitek absorbance previsok. Beer-Lambertov zakon razprševanja ne upošteva; za motne vzorce ali vzorce, ki razpršujejo svetlobo, na primer praške, se uporablja sorodni model, imenovan Kubelka-Munkova teorija.
• Kemijske spremembe med meritvijo. Nekatere snovi se pod vplivom svetlobe razgradijo ali se med merjenjem spreminjajo s pH, zato se odčitek med meritvijo spremeni.
• Temperaturne spremembe. Molarni absorpcijski koeficient je odvisen od temperature, zato meritev pri različnih temperaturah ni mogoče neposredno primerjati.

Zgodovina

Zakon se je več kot stoletje razvijal z delom treh znanstvenikov. Pierre Bouguer je leta 1729 opisal, kako vsaka enako debela plast snovi absorbira enak delež svetlobe, ki prehaja skoznjo. Johann Heinrich Lambert je to povezavo matematično ponovno oblikoval v svoji knjigi Photometria iz leta 1760 in pokazal, da absorbanca narašča premosorazmerno z dolžino optične poti. August Beer je zakon leta 1852 razširil in pokazal, da absorbanca narašča tudi premosorazmerno s koncentracijo. Združeni zakon se včasih v priznanje vsem trem imenuje Bouguer-Beer-Lambertov zakon.

Pogosta vprašanja

Za kaj se uporablja Beer-Lambertov zakon? Izračuna, koliko svetlobe absorbira raztopina, in deluje tudi obratno: iz izmerjene absorbance določi neznano koncentracijo. Zato je temelj UV-Vis spektrofotometrije, pogoste laboratorijske tehnike za merjenje količine snovi v raztopini.

Katere enote uporablja Beer-Lambertov zakon? Dolžina optične poti se izraža v centimetrih, molarni absorpcijski koeficient v L/(mol·cm), koncentracija pa v mol/L. Absorbanca sama nima enot, čeprav je včasih označena z »AU«, kar pomeni enote absorbance. Če v formuli uporabimo druge enote, ne da bi jih prej pretvorili, dobimo napačen rezultat.

Zakaj moja meritev absorbance ni sorazmerna s koncentracijo? Najpogostejši vzroki so koncentracija nad približno 0,01 mol/L, moten vzorec ali vzorec z delci oziroma meritev daleč zunaj območja 0,3–0,9, v katerem so instrumenti najnatančnejši. Z redčenjem vzorca in ponovno meritvijo se običajno potrdi, kateri vzrok je prisoten.

Kakšna je razlika med absorbanco in transmitanco? Transmitanca je delež svetlobe, ki preide skozi vzorec. Absorbanca je negativni logaritem transmitance z osnovo 10: A = −log₁₀(T). Ko absorbanca narašča, transmitanca upada.

Kakšna je razlika med absorbanco in optično gostoto? Gre za isto količino. Izraz »optična gostota« se pogosteje uporablja v biologiji, izraz »absorbanca« pa je pogostejši v kemiji.

Katero območje absorbance je najnatančnejše? Približno 0,3 do 0,9. Pod tem območjem signal prevlada nad šumom instrumenta. Nad približno 1,5 razpršena svetloba v instrumentu povzroča napako, nad približno 2,5 pa večina instrumentov sploh ne more zagotoviti zanesljive meritve.

Viri

1. Beer, A. (1852). »Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten.« Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). »The Beer-Lambert Law.« Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S. in Popp, J. (2020). »The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure.« ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.