Izračunajte učinkovitost PCR iz Ct vrednosti in faktorjev redčenja. Analizirajte standardne krivulje, določite amplifikacijsko učinkovitost in potrdite vaše kvantitativne PCR poskuse.
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vrednost mora biti pozitivna
Vnesite veljavne podatke za generiranje grafikona
Učinkovitost qPCR je mera, kako dobro PCR reakcija deluje. Učinkovitost 100 % pomeni, da se količina PCR produkta podvoji v vsakem ciklu med eksponentialno fazo.
Učinkovitost se izračuna iz naklona standardne krivulje, ki jo dobimo s prikazovanjem Ct vrednosti proti logaritmu začetne koncentracije vzorca (serija redčenja).
Učinkovitost (E) se izračuna z uporabo formule:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kvantitativna polimerazna verižna reakcija (qPCR) učinkovitost je ključni parameter, ki neposredno vpliva na natančnost in zanesljivost vaših qPCR eksperimentov. Kalkulator učinkovitosti qPCR pomaga raziskovalcem določiti, kako učinkovito njihovi PCR reakcije amplificirajo ciljne DNA sekvence s vsakim termalnim ciklom. Idealne qPCR reakcije bi morale imeti učinkovitost med 90-110%, kar pomeni, da se količina PCR produkta približno podvoji s vsakim ciklom med eksponentno fazo.
Slaba amplifikacijska učinkovitost lahko vodi do netočnega kvantificiranja, nezanesljivih rezultatov in napačnih eksperimentalnih zaključkov. Z izračunavanjem in spremljanjem vaše qPCR učinkovitosti lahko optimizirate reakcijske pogoje, validirate zasnove primerov in zagotovite kakovost vaših kvantitativnih PCR podatkov.
Ta kalkulator uporablja metodo standardne krivulje, ki grafično prikazuje vrednosti praga cikla (Ct) v primerjavi z logaritmom koncentracije vzorca (predstavljeno s serijskimi razredčitvami), da določi učinkovitost vašega qPCR testa. Rezultantna naklon te standardne krivulje se nato uporabi za izračun amplifikacijske učinkovitosti s preprosto matematično formulo.
Učinkovitost qPCR reakcije se izračuna iz naklona standardne krivulje z uporabo naslednje formule:
Kjer:
Za idealno PCR reakcijo z 100% učinkovitostjo (popolno podvajanje ampliconov s vsakim ciklom) bi bil naklon -3.32. To je zato, ker:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (ali 100%)}
Učinkovitost v odstotkih se izračuna tako, da decimalno učinkovitost pomnožimo s 100:
\text{Učinkovitost (%)} = E \times 100\%
Standardna krivulja se ustvari z grafičnim prikazom Ct vrednosti (y-os) v primerjavi z logaritmom začetne koncentracije vzorca ali faktorja razredčitve (x-os). Razmerje med tema spremenljivkama bi moralo biti linearno, kakovost te linearne povezave pa se ocenjuje z uporabo koeficienta determinacije (R²).
Za zanesljive izračune učinkovitosti qPCR:
Priprava podatkov: Kalkulator vzame vaše Ct vrednosti za vsako točko razredčitve in faktor razredčitve kot vhodne podatke.
Logaritemska transformacija: Razredčitvena serija se prevede v logaritemsko lestvico (log osnove 10).
Linearno regresijo: Kalkulator izvede analizo linearne regresije na logaritemsko transformiranih podatkih, da določi naklon, y-odsek in R² vrednost.
Izračun učinkovitosti: Z uporabo vrednosti naklona se učinkovitost izračuna z uporabo formule E = 10^(-1/slope) - 1.
Interpretacija rezultatov: Kalkulator prikaže učinkovitost kot odstotek, skupaj z naklonom in R² vrednostjo, da vam pomaga oceniti zanesljivost vašega qPCR testa.
Sledite tem korakom za izračun vaše qPCR učinkovitosti:
Nastavite število razredčitev: Izberite, koliko točk razredčitve imate v svoji standardni krivulji (priporočeno med 3-7 točk).
Vnesite faktor razredčitve: Vnesite faktor razredčitve, ki ste ga uporabili med zaporednimi vzorci (npr. 10 za 10-kratno razredčitev, 5 za 5-kratno razredčitev).
Vnesite Ct vrednosti: Vnesite Ct vrednosti za vsako točko razredčitve. Običajno prva razredčitev (Razredčitev 1) vsebuje najvišjo koncentracijo vzorca, kar povzroči najnižjo Ct vrednost.
Oglejte si rezultate: Kalkulator bo samodejno izračunal in prikazal:
Interpretirajte rezultate: Ocenite, ali vaša qPCR učinkovitost pade v sprejemljiv razpon (90-110%) in ali R² vrednost kaže na zanesljivo standardno krivuljo (≥ 0.98).
Kopirajte rezultate: Uporabite gumb "Kopiraj rezultate", da kopirate vse izračunane vrednosti za vaše evidence ali publikacije.
Poglejmo primer:
Ko so prikazane na standardni krivulji:
Kalkulator bo izvedel linearno regresijo in določil:
Z uporabo formule za učinkovitost:
To kaže na dobro qPCR učinkovitost 93%, kar pade v sprejemljiv razpon 90-110%.
Pred uporabo novega para primerov za kvantitativne eksperimente je nujno preveriti njihovo delovanje. Izračunavanje učinkovitosti qPCR pomaga:
Pri razvoju novih qPCR testov so izračuni učinkovitosti ključni za:
V eksperimentih relativne kvantifikacije je poznavanje PCR učinkovitosti bistveno za:
V kliničnih in diagnostičnih nastavitvah je qPCR učinkovitost pomembna za:
Za okoljske in varnostne aplikacije hrane izračuni učinkovitosti pomagajo:
Medtem ko je metoda standardne krivulje najpogostejši pristop za izračunavanje učinkovitosti qPCR, obstajajo alternativne metode:
Ta metoda izračuna učinkovitost iz fluorescenčnih podatkov enega amplifikacijskega krivulje, ne da bi potrebovala serijo razredčitev. Programska oprema, kot je LinRegPCR, analizira eksponentno fazo posameznih reakcij, da določi učinkovitost.
Prednosti:
Slabosti:
Digitalni PCR (dPCR) omogoča absolutno kvantifikacijo brez potrebe po standardni krivulji ali izračunih učinkovitosti.
Prednosti:
Slabosti:
Nekatera programska oprema za analizo qPCR ponuja metode primerjalne kvantifikacije, ki ocenjujejo učinkovitost brez popolne standardne krivulje.
Prednosti:
Slabosti:
Razvoj qPCR in izračunov učinkovitosti se je v zadnjih nekaj desetletjih znatno razvil:
Polimerazna verižna reakcija (PCR) je bila izumljena s strani Kary Mullis leta 1983, kar je revolucioniralo molekularno biologijo. Vendar je bila tradicionalna PCR le kvalitativna ali pol-kvantitativna. Prvi sistem realnočasnega PCR je bil razvit v zgodnjih 90-ih letih s strani Russella Higuchija in njegovih sodelavcev, ki so pokazali, da lahko spremljanje PCR produktov, ko se kopičijo (z uporabo fluorescencije etidija bromida), zagotovi kvantitativne informacije.
Ko se je tehnologija qPCR razvijala, so raziskovalci prepoznali pomen standardizacije in validacije. Koncept učinkovitosti PCR je postal osrednjega pomena za zanesljivo kvantifikacijo:
Področje se je nadalje razvijalo z:
Danes je izračunavanje in poročanje o učinkovitosti qPCR obvezno za objavo zanesljivih qPCR podatkov, orodja, kot je ta kalkulator, pa raziskovalcem pomagajo, da se držijo najboljših praks na tem področju.
1' Excel formula for calculating qPCR efficiency from slope
2' Place in cell B2 if slope is in cell A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formula to convert efficiency to percentage
6' Place in cell C2 if efficiency decimal is in cell B2
7=B2*100
8
9' Function to calculate efficiency from Ct values and dilution factor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Calculate linear regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Calculate slope
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Calculate efficiency
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R function to calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Create log dilution values
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Perform linear regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extract slope and R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Calculate efficiency
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Return results
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Example usage
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Učinkovitost: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Naklon: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor.
8
9 Parameters:
10 ct_values (list): List of Ct values
11 dilution_factor (float): Dilution factor between consecutive samples
12
13 Returns:
14 dict: Dictionary containing efficiency, slope, r_squared, and intercept
15 """
16 # Create log dilution values
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Perform linear regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Calculate efficiency
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot the standard curve with regression line.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generate points for regression line
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Razredčitev')
48 plt.ylabel('Ct Vrednost')
49 plt.title('qPCR Standardna Krivulja')
50
51 # Add equation and R² to plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Učinkovitost = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Example usage
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Učinkovitost: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Naklon: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-odsek: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot the standard curve
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array of Ct values
4 * @param {number} dilutionFactor - Dilution factor between consecutive samples
5 * @returns {Object} Object containing efficiency, slope, rSquared, and intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Create log dilution values
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Calculate means for linear regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Calculate slope and intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Calculate R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Calculate efficiency
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Example usage
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Učinkovitost: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Naklon: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-odsek: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Dobra qPCR učinkovitost običajno pade med 90% in 110% (0.9-1.1). Učinkovitost 100% predstavlja popolno podvajanje PCR produkta s vsakim ciklom. Učinkovitosti izven tega razpona lahko kažejo na težave z zasnovo primerov, reakcijskimi pogoji ali prisotnostjo inhibitorjev.
Učinkovitosti, ki so večje od 100%, se lahko pojavijo zaradi:
Nizka R² vrednost (pod 0.98) nakazuje slabo linearno povezavo v vaši standardni krivulji, kar lahko povzroči:
Za zanesljive izračune učinkovitosti je potrebna najmanj 3 točke razredčitve, vendar je priporočljivo 5-6 točk za bolj natančne rezultate. Te točke bi morale pokrivati celoten dinamični razpon pričakovanih koncentracij vzorca v vaših eksperimentalnih vzorcih.
Pri relativni kvantifikaciji z uporabo metode ΔΔCt se predpostavlja, da sta učinkovitosti med ciljnimi in referenčnimi geni enaki (ideally 100%). Ko se učinkovitosti znatno razlikujejo:
Ne, učinkovitost je treba določiti za vsak par primerov in jo je treba ponovno validirati:
Inhibitorji PCR lahko:
Izrazi se pogosto uporabljajo izmenično, vendar:
Za izboljšanje učinkovitosti qPCR:
Primerjanje vzorcev z znatno različnimi učinkovitostmi ni priporočljivo, ker:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Naš kalkulator učinkovitosti qPCR zagotavlja preprosto, a močno orodje za raziskovalce, da validirajo in optimizirajo svoje kvantitativne PCR eksperimente. Z natančnim izračunavanjem učinkovitosti iz standardnih krivulj lahko zagotovite zanesljivo kvantifikacijo, odpravite težave s testi in se držite najboljših praks v eksperimentiranju qPCR.
Preizkusite naš kalkulator danes, da izboljšate kakovost in zanesljivost vaših qPCR podatkov!
Odkrijte več orodij, ki bi lahko bila koristna za vaš delovni proces