Kalkulator učinkovitosti qPCR: Orodje za analizo standardne krivulje

Kalkulator učinkovitosti qPCR

Kalkulator učinkovitosti qPCR oceni, kako dobro reakcija kvantitativne PCR (qPCR) pri vsakem ciklu pomnoževanja kopira ciljno zaporedje DNK. Pri tem iz serije redčitev uporablja vrednosti Ct (številko cikla, pri kateri fluorescenčni signal preseže določen prag) za izračun učinkovitosti, naklona, presečišča in R².

Kaj je učinkovitost qPCR?

Kvantitativna PCR spremlja fluorescenco, ko reakcija cikel za ciklom kopira ciljno zaporedje DNK. Učinkovitost pomnoževanja opisuje, za koliko se količina ciljne DNK poveča v vsakem ciklu. Pri učinkovitosti 100 % se količina ciljne DNK v vsakem ciklu podvoji.

Resnične reakcije le redko dosežejo natanko 100 %. Večina laboratorijev šteje učinkovitost med 90 % in 110 % za sprejemljivo za zanesljivo kvantifikacijo. Vrednost pod 90 % ali nad 110 % kaže na težavo, kot so slabo načrtovani začetni oligonukleotidi, inhibitorji PCR, preneseni iz ekstrakcije vzorca, ali napake pri pipetiranju v seriji redčitev.

Učinkovitost je najpomembnejša pri primerjanju izražanja genov med vzorci. Običajna metoda ΔΔCt za izračun kratne spremembe predpostavlja, da vsaka reakcija poteka z učinkovitostjo 100 %. Če se izmerjena učinkovitost razlikuje od 100 % ali če imata ciljni gen in referenčni gen različni učinkovitosti, so lahko rezultati kratne spremembe netočni.

Formula za učinkovitost qPCR

Učinkovitost se izračuna iz naklona standardne krivulje, premice, dobljene z vrisom vrednosti Ct glede na logaritem z osnovo 10 (log10) količine začetne DNK v seriji redčitev.

E = 10^(-1/naklon) - 1

E je učinkovitost, izražena kot decimalno število (za odstotke jo pomnožimo s 100). Naklon je naklon premice standardne krivulje. Je negativen, ker Ct narašča, ko količina začetne DNK upada.

Naklon -3,32 ustreza učinkovitosti 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

To velja zato, ker bi morala 10-kratna redčitev premakniti Ct za približno 3,32 cikla, če se DNK v reakciji podvoji v vsakem ciklu, saj je log2(10) približno 3,32.

V praksi je naklon med -3,1 in -3,6 sprejemljiv. To območje ustreza učinkovitosti približno od 90 % do 110 %. Naklon, bliže -3,1, daje višjo izračunano učinkovitost, naklon, bliže -3,6, pa nižjo.

Kako izračunati učinkovitost qPCR: metoda standardne krivulje

1. Pripravite serijo redčitev. Začnite z najbolj koncentriranim vzorcem in ga za vsak naslednji vzorec razredčite s stalnim faktorjem, običajno 10-krat. Izvedite qPCR za vsako redčitev in zabeležite njeno vrednost Ct.
2. Vsako redčitev pretvorite v vrednost log10. Če prvi, najbolj koncentrirani vzorec štejemo kot položaj 0, je log10(relativne količine) vzorca s številko i enak -i × log10(faktorja redčenja).
3. Za vsako redčitev vrišite Ct (navpična os) glede na vrednost log10 (vodoravna os) in izvedite linearno regresijo.
4. Odčitajte naklon, presečišče in R² regresijske premice.
5. Naklon vstavite v E = 10^(-1/naklon) - 1, da dobite učinkovitost.

Merila kakovosti standardne krivulje

• R² najmanj 0,98. To meri, kako dobro se točke prilegajo premici. Nižja vrednost pogosto kaže na napake pri pipetiranju ali neenakomerno pomnoževanje.
• Naklon med -3,1 in -3,6. To območje ustreza učinkovitosti 90–110%.
• Najmanj tri točke redčitve. Pet ali šest točk da zanesljivejšo premico in olajša prepoznavanje osamelca.
• Najbolj koncentrirani vzorec bi moral dati Ct približno 15-20. Najbolj razredčeni vzorec bi moral ostati pod Ct 35, saj se vrednosti nad tem približujejo meji zaznave.

Rešen primer

Serija redčitev s petimi točkami in 10-kratnim redčenjem daje naslednje vrednosti Ct od najbolj do najmanj koncentriranega vzorca: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Vrednosti log10(relativne količine) so 0, -1, -2, -3, -4, saj vsak korak redčenja doda -log10(10) oziroma -1. Ct se pri vsakem koraku poveča za 3,5 cikla, zato točke ležijo na premici in linearna regresija da:

• Naklon: -3,5
• Presečišče: 15,0
• R²: 1,0

Učinkovitost: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931 oziroma približno 93 %.

Učinkovitost 93 % z R² = 1,0 izpolnjuje standardna merila kakovosti in je primerna za kvantifikacijo izražanja genov.

Primer kode

Ta funkcija JavaScript uporablja enako metodo kot kalkulator. Indeks vsake vrednosti Ct se pred logaritmiranjem negira, ker ima prvi, najbolj koncentrirani vzorec največjo relativno količino, vsak naslednji vzorec pa je bolj razredčen.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Zakaj je učinkovitost pomembna za izražanje genov

Izračuni spremembe kratnosti, vključno z metodo ΔΔCt, predpostavljajo, da vsaka reakcija v vsakem ciklu podvoji svojo ciljno količino. Kadar imata ciljni gen in referenčni gen različni izmerjeni učinkovitosti, navadna formula ΔΔCt povzroči napako. Raziskovalci pogosto preidejo na izračun s korekcijo učinkovitosti, kot je metoda, ki jo je Michael Pfaffl opisal leta 2001, kadar se učinkovitosti razlikujeta za več kot približno pet odstotnih točk. Smernice MIQE, pogosto citiran sklop standardov poročanja za qPCR, objavljen leta 2009, priporočajo, da študije poleg rezultatov kvantifikacije navedejo izračunano učinkovitost, naklon in R².

Pogosta vprašanja

Kolikšen odstotek učinkovitosti qPCR je dober?

Na splošno je sprejemljivo območje med 90 % in 110 %, pri dobro optimiziranih testih pa so vrednosti okoli 95–105%. Naklon -3,32 ustreza natanko 100 %.

Zakaj je moja učinkovitost qPCR nad 110 %?

Pogosti vzroki vključujejo napake pri pipetiranju v seriji redčitev, dimere začetnih oligonukleotidov, inhibitorje, ki neenakomerno vplivajo na koncentrirane in razredčene vzorce, ali fluorescenčni prag, nastavljen zunaj eksponentne faze pomnoževanja. Talilna krivulja z več kot enim vrhom lahko kaže na dimere začetnih oligonukleotidov.

Zakaj je moja učinkovitost qPCR pod 90 %?

Verjetni vzroki vključujejo neustrezno zasnovo začetnih oligonukleotidov, inhibitorje PCR, prenesene iz ekstrakcije vzorca, ali neoptimalno temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov. Preverjanje specifičnosti začetnih oligonukleotidov in izvedba temperaturnega gradienta lahko pomagata najti vzrok.

Kaj pomeni nizka vrednost R²?

R² meri, kako dobro se vrednosti Ct ujemajo s premico v odvisnosti od logaritemske količine. Vrednost pod 0,98 kaže na nedosledno pipetiranje, inhibiran vzorec ali točko redčenja blizu meje zaznave.

Koliko točk redčenja potrebuje standardna krivulja?

Najmanj tri, kar je najmanjše število, potrebno za linearno regresijo. Pet ali šest točk daje zanesljivejši naklon in olajša prepoznavanje osamelcev.

Ali se lahko učinkovitost med poskusi spremeni?

Da. Nova serija reagenta, nova serija začetnih oligonukleotidov, drugačna vrsta vzorca ali drugačen instrument qPCR lahko spremenijo učinkovitost. Številni laboratoriji učinkovitost ponovno preverijo vsakih nekaj mesecev ali ob vsaki novi seriji reagentov.

Viri

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA idr. Smernice MIQE: minimalne informacije za objavo poskusov kvantitativne PCR v realnem času. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Nov matematični model za relativno kvantifikacijo pri RT-PCR v realnem času. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kako dobra je ocena učinkovitosti PCR: priporočila za natančno in zanesljivo ocenjevanje učinkovitosti qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.