Kalkulator koncentracije DNA | Pretvornik A260 v ng/μL

Kalkulator koncentracije DNK

Kalkulator koncentracije DNK pretvori meritev absorbance UV-svetlobe pri 260 nanometrih, imenovano A260, v koncentracijo DNK v nanogramih na mikroliter (ng/µL). Poroča tudi o skupni količini DNK v vzorcu v mikrogramih (µg).

Kaj je absorbanca A260?

A260 je količina ultravijolične svetlobe, ki jo raztopina absorbira pri valovni dolžini 260 nanometrov. DNK pri tej valovni dolžini najmočneje absorbira UV-svetlobo zaradi svojih nukleotidnih baz. Spektrofotometer izmeri A260 po meritvi slepega vzorca, pri kateri se uporabi isti pufer kot pri vzorcu in odstrani absorbanca ozadja. Več DNK kot je v raztopini, višja je izmerjena vrednost A260.

Formula za koncentracijo DNK

Dvoverižna DNK absorbira UV-svetlobo sorazmerno s svojo koncentracijo; to povezavo opisuje Beer-Lambertov zakon. Pri standardni 1-centimetrski optični poti raztopina z vrednostjo A260 1,0 vsebuje približno 50 ng/µL dvoverižne DNK. Ta vrednost, pretvorbeni faktor, vsako meritev A260 pretvori v koncentracijo:

Koncentracija DNK (ng/µL) = A260 × 50 × faktor redčenja

Faktor redčenja upošteva vsako redčenje, opravljeno pred meritvijo vzorca. Pri vzorcu, izmerjenem brez redčenja, je faktor redčenja 1.

Kako izračunati skupni izkoristek DNK

Ko je koncentracija znana, lahko skupno maso DNK v vzorcu določimo iz njegove prostornine:

Skupna količina DNK (µg) = koncentracija (ng/µL) × prostornina (µL) ÷ 1000

Kako izračunati koncentracijo DNK: korak za korakom

1. Pred merjenjem vzorec temeljito premešajte. DNK se lahko oprime sten epruvete ali se neenakomerno usede.
2. Če je vzorec zelo koncentriran, ga razredčite tako, da bo vrednost A260 med 0,1 in 1,0. Meritve spektrofotometra so zunaj tega območja najmanj zanesljive.
3. Spektrofotometer nastavite na slepi vzorec z istim pufrom, kot ste ga uporabili za redčenje, nato izmerite vzorec pri 260 nm.
4. V kalkulator vnesite vrednost A260, prostornino vzorca in faktor redčenja, da dobite koncentracijo in skupni izkoristek. Pred prikazom rezultata morajo biti izpolnjena vsa tri polja, prostornina pa mora biti večja od nič.

Primer izračuna

Primer 1: nerazredčen vzorec

Vrednost A260 je 0,5, redčenja ni (faktor redčenja 1), prostornina vzorca pa je 100 µL.

• Koncentracija = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Skupna količina DNK = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Primer 2: razredčen vzorec

Epruveta vsebuje 50 µL prečiščene DNK. Majhen del vzorca je bil redčen 10-krat, v razredčenem delu pa je bila izmerjena vrednost A260 0,75. Faktor redčenja to vrednost pretvori nazaj v koncentracijo v prvotni epruveti, prostornina 50 µL pa se vnese pri izračunu skupnega izkoristka.

• Koncentracija = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Skupna količina DNK = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Izračun faktorja redčenja

Faktor redčenja = skupna prostornina po redčenju ÷ prostornina prvotnega vzorca.

Če raztopini DNK dodamo 5 µL pufra 45 µL, dobimo skupno prostornino 50 µL, zato je faktor redčenja 50 ÷ 5 = 10. Pri vzorcu, ki ni bil razredčen, je faktor redčenja 1.

Običajni razponi koncentracije DNK

Koncentracija je odvisna od vrste vzorca in metode ekstrakcije. Pri ekstrakciji genomske DNK je običajna koncentracija približno med 10 in 100 ng/µL. Pri pripravi plazmidne DNK so koncentracije pogosto višje, včasih več sto ng/µL. Rezultat, ki je za določeno metodo precej zunaj pričakovanega razpona, lahko kaže na težavo pri ekstrakciji ali sami meritvi.

Omejitve merjenja absorbance UV-svetlobe

Merjenje A260 je hitro, vendar ni najbolj občutljiva ali specifična metoda za DNK. Tudi beljakovine, RNK in nekatere sestavine pufra absorbirajo svetlobo v bližini 260 nm in lahko povečajo izmerjeno vrednost. Znanstveniki pogosto poleg koncentracije preverijo razmerje A260/A280, da ocenijo morebitno onesnaženje z beljakovinami; razmerje približno 1,8 običajno kaže na čist vzorec DNK. Metode na osnovi fluorescentnih barvil, kot so testi Qubit, se vežejo samo na dvoverižno DNK in omogočajo natančnejšo meritev pri razredčenih ali nečistih vzorcih, vendar zahtevajo dodatne reagente in fluorometer.

Pogosta vprašanja

Kako izračunati koncentracijo DNK iz A260?

Vrednost A260 pomnožite s 50, standardnim pretvorbenim faktorjem za dvoverižno DNK, nato rezultat pomnožite s faktorjem redčenja. Če vzorec ni bil razredčen, uporabite faktor redčenja 1.

Kakšno je dobro razmerje A260/A280?

Razmerje približno 1,8 običajno kaže na čist vzorec DNK. Nižje razmerje nakazuje onesnaženje z beljakovinami. Razmerje nad 2,0 lahko kaže na onesnaženje z RNK.

Ali se ta kalkulator lahko uporablja za RNK?

Ne neposredno, ker se pri RNK namesto 50 uporablja pretvorbeni faktor 40 ng/µL. Za oceno koncentracije RNK rezultat kalkulatorja pomnožite z 0,8 (40 ÷ 50) ali neposredno uporabite A260 × 40 × faktor redčenja.

Zakaj mora biti vrednost A260 med 0,1 in 1,0?

Absorbanca ostaja približno sorazmerna s koncentracijo, kot opisuje Beer-Lambertov zakon, predvsem znotraj tega območja. Zunaj njega so meritve manj zanesljive, zato je treba preveč koncentriran ali preveč razredčen vzorec pred ponovno meritvijo razredčiti ali koncentrirati.

Kakšna je razlika med koncentracijo in čistostjo?

Koncentracija meri količino prisotne DNK v ng/µL. Čistost meri, kako čist je vzorec, predvsem na podlagi absorbancijskih razmerij, kot je A260/A280. Vzorec ima lahko visoko koncentracijo in je kljub temu nečist ali pa ima nizko koncentracijo in je zelo čist.

Kako pretvoriti ng/µL v µg/mL?

Enoti sta številčno enaki. 1 ng/µL je enako 1 µg/mL, ker se enota mase in enota prostornine povečata oziroma zmanjšata za faktor 1000.

Viri

1. Sambrook, J., in Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izd.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., in Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.