Kalkulator za ligacijo DNA - Izračun razmerij med vstavitvijo in vektorjem za molekularno kloniranje

Ligacija DNA je korak pri molekularnem kloniranju, pri katerem se vstavljeni fragment z encimom T4 DNA-ligazo združi s plazmidnim vektorjem. Kalkulator ligacije DNA izračuna, koliko mikrolitrov vstavljene DNA in vektorske DNA je treba zmešati, da reakcija doseže izbrano molarno razmerje med vstavkom in vektorjem.

Kaj počne kalkulator

Kalkulator sprejme šest vnosov: koncentracijo vektorja, dolžino vektorja, koncentracijo vstavka, dolžino vstavka, ciljno molarno razmerje med vstavkom in vektorjem ter skupni volumen reakcije. Omogoča tudi nastavitev količine uporabljene vektorske DNA, ki je privzeto 50 nanogramov (ng). Na podlagi teh vrednosti izračuna volumen vektorja, ki ga je treba odpipetirati, volumen vstavka, ki ga je treba odpipetirati, ter količino pufra ali vode, ki jo je treba dodati do skupnega volumna reakcije.

Koncentracija se meri v nanogramih na mikroliter (ng/μL), običajno se odčita z instrumentom Nanodrop ali Qubit. Dolžina se meri v baznih parih (bp). En kilobaz (kb) ustreza 1000 baznim parom. Molarno razmerje opisuje, koliko molekul vstavka naj bo prisotnih na vsako molekulo vektorja. Ne gre za masno razmerje.

Zakaj se uporablja molarno razmerje in ne masa

Enaki masi DNA ne vsebujeta enakega števila molekul. Kratek vstavek ima manjšo maso kot dolg vektor pri enakem številu molekul. Če bi zmešali enaki količini kratkega vstavka in dolgega vektorja v nanogramih, bi bilo molekul vstavka glede na molekule vektorja veliko premalo. Kalkulator prilagodi maso vstavka glede na razmerje dolžin fragmentov, tako da ima končna zmes predvideno število molekul vstavka na molekulo vektorja.

Formula za ligacijo DNA

Potrebna količina vstavljene DNA v nanogramih je:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

kjer je $m_i$ količina vstavka v nanogramih, $m_v$ količina vektorja v nanogramih, $k_i$ dolžina vstavka v kilobaznih parih, $k_v$ dolžina vektorja v kilobaznih parih, R pa ciljno molarno razmerje med vstavkom in vektorjem.

Ko je ta količina znana, kalkulator vsako količino pretvori v volumen, primeren za odpipetiranje:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

kjer sta $V_v$ in $V_i$ volumna vektorja in vstavka v mikrolitrih, $c_v$ in $c_i$ koncentraciji vektorja in vstavka v nanogramih na mikroliter, $V_b$ volumen pufra, $V_t$ pa skupni volumen reakcije.

Če sta volumna vektorja in vstavka skupaj večja od skupnega volumna reakcije, za pufer, ligazo ali vodo ne ostane prostora. V tem primeru kalkulator javi, da je skupni volumen premajhen, namesto da bi prikazal negativno količino pufra.

Rešen primer

Raziskovalec klonira genski fragment velikosti 1 kb v plazmidni vektor velikosti 3 kb. Načrtuje uporabo 50 ng vektorske DNA pri molarnem razmerju vstavka in vektorja 3:1 v reakciji volumna 20 μL.

Vnosi:

• Koncentracija vektorja: 50 ng/μL
• Dolžina vektorja: 3000 bp (3 kb)
• Koncentracija vstavka: 25 ng/μL
• Dolžina vstavka: 1000 bp (1 kb)
• Molarno razmerje: 3
• Skupni volumen: 20 μL
• Količina vektorja: 50 ng

Korak 1: količina vstavka

ng vstavka = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Korak 2: volumni

Volumen vektorja = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volumen vstavka = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volumen pufra = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakcija vsebuje 1 μL vektorja, 2 μL vstavka ter 17 μL pufra ali vode, kamor se doda tudi ligaza z reakcijskim pufrom. Ta zmes zagotavlja tri molekule vstavka na vsako molekulo vektorja.

Običajna molarna razmerja pri ligaciji

Pri večini standardnih kloniranj z lepljivimi, štrlečimi konci se uporablja razmerje med vstavkom in vektorjem 3:1. Ligacije, pri katerih se združujejo topi konci, so manj učinkovite, zato je običajno večje razmerje, na primer 5:1. Zelo veliki vstavki včasih bolje delujejo pri manjšem razmerju, bliže 1:1, saj veliki fragmenti že sami prispevajo veliko baznih parov na molekulo.

Pogosta vprašanja

Kaj je ligacija DNA?

Ligacija DNA je združitev dveh fragmentov DNA, običajno plazmidnega vektorja in vstavka, v eno neprekinjeno molekulo. Encim T4 DNA-ligaza zapečati povezavo med koncema fragmentov.

Kaj pomeni molarno razmerje vstavka in vektorja?

To je število molekul vstavljene DNA na vsako molekulo vektorja v reakciji. Razmerje 3:1 pomeni tri molekule vstavka na vsako molekulo vektorja, ne glede na primerjavo njunih mas.

Zakaj ne uporabiti enakih količin vektorja in vstavka v nanogramih?

Fragmenti DNA različnih dolžin imajo različne mase na molekulo. Vstavek velikosti 1 kb ima približno tretjino mase vektorja velikosti 3 kb, če primerjamo posamezne molekule. Enaki količini vsakega fragmenta v nanogramih ne bi dali enakega števila molekul, zato kalkulator prilagodi maso vstavka, da ustreza ciljnemu molarnemu razmerju.

Kaj pomeni, če je skupni volumen premajhen?

To pomeni, da volumna vektorja in vstavka že sama porabita celoten volumen reakcije, zato ne ostane prostora za pufer ali ligazo. Rešitev je povečati skupni volumen reakcije ali uporabiti bolj koncentrirane zaloge DNA.

Ali je ta kalkulator mogoče uporabiti za kloniranje Gibson Assembly ali Golden Gate?

Ne. Ti metodi uporabljata drugačno kemijo reakcije in običajno ciljata na ekvimolarne količine vseh fragmentov, ne pa na določeno razmerje vstavka in vektorja. Izračuni volumnov se razlikujejo od standardnega kloniranja s T4-ligazo.

Koliko vektorske DNA se običajno uporabi?

50 ng je običajna začetna količina za standardno ligacijsko reakcijo. V laboratorijih se uporabljajo tudi količine od 25 do 100 ng, prilagojene koncentraciji DNA in obsegu reakcije.