DNA Ligation Calculator

Introduction

DNA ligacija je ključna tehnika molekularne biologije, ki se uporablja za povezovanje DNA fragmentov skupaj s kovalentnimi vezmi. DNA Ligation Calculator je bistveno orodje za raziskovalce, ki pomaga določiti optimalne količine vektorja in vstavljenih DNA potrebnih za uspešne ligacijske reakcije. S tem, ko izračuna pravilne molarne razmerja med vektorjem (plazmidom) in vstavljenimi DNA fragmenti, to orodje zagotavlja učinkovite eksperimente molekularnega kloniranja, hkrati pa zmanjšuje izgubo reagensov in neuspešne reakcije.

Ligacijske reakcije so temeljne za gensko inženirstvo, sintetično biologijo in postopke molekularnega kloniranja. Omogočajo znanstvenikom, da ustvarijo rekombinantne DNA molekule z vstavitvijo genov, ki jih zanima, v plazmidne vektorje za kasnejšo transformacijo v gostiteljske organizme. Uspeh teh reakcij je močno odvisen od uporabe ustreznih količin DNA komponent, kar je natančno tisto, kar to orodje pomaga določiti.

Ne glede na to, ali konstruirate izražalne vektorje, ustvarjate genetske knjižnice ali izvajate rutinske subkloniranja, vam bo ta DNA ligacijski kalkulator pomagal optimizirati vaše eksperimentalne pogoje in povečati vašo stopnjo uspeha. Z vnosom nekaj ključnih parametrov o vaših DNA vzorcih lahko hitro pridobite točne volumnov, potrebnih za vašo specifično ligacijsko reakcijo.

Formula/Calculation

DNA ligacijski kalkulator uporablja temeljno formulo molekularne biologije, ki upošteva različne velikosti in koncentracije DNA fragmentov, ki jih združujemo. Glavni izračun določa, koliko vstavljenih DNA je potrebnih v primerjavi z vektorsko DNA na podlagi njihovih dolžin in želenega molarnega razmerja.

Insert Amount Calculation

Količina potrebne vstavne DNA (v nanogramih) se izračuna z naslednjo formulo:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Kjer:

• ng of vector = količina vektorske DNA, uporabljene v reakciji (običajno 50-100 ng)
• kb size of insert = dolžina vstavljenega DNA fragmenta v kilobazah (kb)
• kb size of vector = dolžina vektorske DNA v kilobazah (kb)
• molar ratio = želeno razmerje med vstavljenimi molekulami in vektorskimi molekulami (običajno 3:1 do 5:1)

Volume Calculations

Ko je določena potrebna količina vstavne DNA, se izračunajo potrebni volumi za reakcijo:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Example Calculation

Poglejmo praktičen primer:

• Koncentracija vektorja: 50 ng/μL
• Dolžina vektorja: 3000 bp (3 kb)
• Koncentracija vstavka: 25 ng/μL
• Dolžina vstavka: 1000 bp (1 kb)
• Želeno molarno razmerje (vstavek:vektor): 3:1
• Skupni volumen reakcije: 20 μL
• Količina vektorja, ki jo želite uporabiti: 50 ng

Korak 1: Izračunajte zahtevano količino vstavka $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Korak 2: Izračunajte volume $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Ta izračun zagotavlja, da so v reakciji tri molekule vstavka za vsako molekulo vektorja, kar optimizira možnosti uspešne ligacije.

Step-by-Step Guide to Using the Calculator

Naš DNA ligacijski kalkulator je zasnovan tako, da je intuitiven in enostaven za uporabo. Sledite tem korakom, da izračunate optimalne volume za vašo ligacijsko reakcijo:

1. Vnesite informacije o vektorju:

   • Vnesite koncentracijo vašega vektorja v ng/μL
   • Vnesite dolžino vektorja v baznih parih (bp)
   • Določite količino vektorske DNA, ki jo želite uporabiti v reakciji (ng)

2. Vnesite informacije o vstavku:

   • Vnesite koncentracijo vašega vstavka v ng/μL
   • Vnesite dolžino vstavka v baznih parih (bp)

3. Nastavite parametre reakcije:

   • Določite želeno molarno razmerje (vstavek:vektor) - običajno med 3:1 in 5:1
   • Vnesite skupni volumen reakcije v μL (običajno 10-20 μL)

4. Ogled rezultatov:

   • Kalkulator bo samodejno prikazal:
     • Potreben volumen vektorja (μL)
     • Potreben volumen vstavka (μL)
     • Količino puferja/vode, ki jo je treba dodati (μL)
     • Skupni volumen reakcije (μL)
     • Količino vektorske in vstavne DNA v reakciji (ng)

5. Kopirajte rezultate (neobvezno):

   • Uporabite gumb "Kopiraj rezultate", da kopirate vse izračune v odložišče za vaš laboratorijski zvezek ali protokole

Kalkulator izvaja preverjanja veljavnosti, da zagotovi, da so vsi vnosi pozitivne številke in da je skupni volumen zadosten za zahtevane DNA volume. Če so zaznane napake, bodo koristna sporočila o napakah vodila k popravku vhodov.

Use Cases

DNA ligacijski kalkulator je koristen v številnih aplikacijah molekularne biologije:

Molekularno kloniranje

Najbolj pogosta uporaba je standardno molekularno kloniranje, kjer raziskovalci vstavijo gene ali DNA fragmente v plazmidne vektorje. Kalkulator zagotavlja optimalne pogoje za:

• Subkloniranje genov med različnimi izražalnimi vektorji
• Ustvarjanje fuzijskih proteinov z združevanjem več genetskih fragmentov
• Konstrukcijo reporter genov
• Gradnjo plazmidnih knjižnic

Sintetična biologija

V sintetični biologiji, kjer se pogosto sestavlja več DNA fragmentov:

• Reakcije Gibson Assembly koristijo natančne razmerja vstavka:vektorja
• Sistemi Golden Gate assembly zahtevajo specifične koncentracije DNA
• BioBrick sestavljanje standardiziranih genetskih delov
• Konstrukcija sintetičnih genetskih vezij

Razvoj diagnostičnih kompletov

Pri razvoju molekularnih diagnostičnih orodij:

• Kloniranje genetskih markerjev specifičnih za bolezni
• Konstrukcija pozitivnih kontrolnih plazmidov
• Razvoj kalibracijskih standardov za qPCR

Sistemi izražanja proteinov

Za raziskovalce, ki delajo na proizvodnji proteinov:

• Optimizacija razmerij vstavka:vektorja za vektorske sisteme visoke kopije
• Konstrukcija inducibilnih izražalnih sistemov
• Ustvarjanje sekrecijskih vektorjev za čiščenje proteinov

CRISPR-Cas9 aplikacije

V aplikacijah za genomsko urejanje:

• Kloniranje vodilnih RNA v CRISPR vektorje
• Ustvarjanje donorskih predlog za homološko usmerjeno popravilo
• Gradnja knjižnic vodilnih RNA za presejanje

Izzivne ligacije

Kalkulator je še posebej koristen za izzivne ligacijske scenarije:

• Kloniranje velikih vstavkov (>5 kb)
• Vstavki zelo majhnih fragmentov (<100 bp)
• Blunt-end ligacije, ki imajo nižjo učinkovitost
• Sestavljanje več fragmentov

Alternatives

Medtem ko naš DNA ligacijski kalkulator zagotavlja natančne izračune za tradicionalne ligacijske reakcije, obstaja več alternativnih pristopov za združevanje DNA fragmentov:

1. Gibson Assembly: Uporablja eksonukleazo, polimerazo in ligazo v enotni reakciji za združevanje prekrivajočih se DNA fragmentov. Ni potrebno tradicionalno ligacijsko izračunavanje, vendar so razmerja koncentracij še vedno pomembna.

2. Golden Gate Assembly: Uporablja encime tipa IIS za usmerjeno, brezšivno sestavljanje več fragmentov. Zahteva ekvivalentne količine vseh fragmentov.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Uporablja eksonukleazo za ustvarjanje enoverižnih preklopov, ki se med seboj združujejo. Običajno uporablja ekvivalentne razmerja fragmentov.

4. In-Fusion Cloning: Komercialni sistem, ki omogoča združevanje fragmentov s 15 bp preklopi. Uporablja specifično razmerje na podlagi velikosti fragmentov.

5. Gateway Cloning: Uporablja specifično recombinacijo namesto ligacije. Zahteva specifične vstopne in ciljne vektorje.

6. Empirično testiranje: Nekatere laboratorije raje nastavijo več ligacijskih reakcij z različnimi razmerji vstavka:vektorja (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) in ugotovijo, katero najbolje deluje za njihove specifične konstrukte.

7. Programsko orodje: Komercialni programski paketi, kot sta Vector NTI in SnapGene, vključujejo ligacijske kalkulatorje z dodatnimi funkcijami, kot je analiza restrikcijskih mest.

History

Razvoj izračunov DNA ligacije se ujema z evolucijo tehnik molekularnega kloniranja, ki so revolucionirale molekularno biologijo in biotehnologijo.

Early Developments (1970s)

Koncept DNA ligacije za molekularno kloniranje se je pojavil v zgodnjih 1970-ih s pionirskim delom Paula Berga, Herberta Boyerja in Stanleya Cohena, ki so razvili prve rekombinantne DNA molekule. V tem obdobju so bile ligacijske reakcije večinoma empirične, raziskovalci pa so uporabljali poskus in napako, da bi določili optimalne pogoje.

Odkritje restrikcijskih encimov in DNA ligaze je zagotovilo osnovna orodja za rezanje in ponovno povezovanje DNA molekul. T4 DNA ligaza, izolirana iz T4 bakteriofaga, okuženega z E. coli, je postala standardni encim za združevanje DNA fragmentov zaradi svoje sposobnosti ligacije tako blunt kot kohezivnih koncev.

Refinement Period (1980s-1990s)

Ko je molekularno kloniranje postalo bolj rutinsko, so raziskovalci začeli razvijati sistematičnejše pristope k ligacijskim reakcijam. Pomembnost molarnih razmerij med vektorsko in vstavno DNA je postala očitna, kar je privedlo do razvoja osnovne formule, ki se še vedno uporablja danes.

V tem obdobju so raziskovalci ugotovili, da povečanje količine vstavne DNA (običajno 3:1 do 5:1 molarno razmerje v klonirnih aplikacijah) običajno izboljša učinkovitost ligacije. To znanje je bilo sprva deljeno prek laboratorijskih protokolov in postopoma prišlo v priročnike in učbenike molekularne biologije.

Modern Era (2000s-Present)

Pojav računalniških orodij in spletnih kalkulatorjev v 2000-ih je omogočil natančnejše izračune ligacije, ki so postali bolj dostopni raziskovalcem. Ko so postale tehnike molekularne biologije bolj sofisticirane, je postala potreba po natančnih izračunih bolj kritična, zlasti za izzivne klonirne projekte, ki vključujejo več fragmentov ali velike vstavke.

Danes so izračuni DNA ligacije sestavni del delovnih tokov molekularnega kloniranja, z namenskimi kalkulatorji, kot je ta, ki raziskovalcem pomaga optimizirati njihove eksperimente. Osnovna formula je ostala večinoma nespremenjena, čeprav se je naše razumevanje dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost ligacije, izboljšalo.

Pojav alternativnih metod kloniranja, kot sta Gibson Assembly in Golden Gate kloniranje, je uvedel nove potrebe po izračunih, vendar ostaja temeljni koncept molarnih razmerij med DNA fragmenti pomemben tudi pri teh tehnikah.

Code Examples

Tukaj so implementacije DNA ligacijskega kalkulatorja v različnih programskih jezikih:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculate required insert amount in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculate vector volume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculate insert volume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculate buffer/water volume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Usage example in a cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calculate volumes for a DNA ligation reaction.
5    
6    Parameters:
7    vector_concentration (float): Concentration of vector DNA in ng/μL
8    vector_length (float): Length of vector DNA in base pairs
9    insert_concentration (float): Concentration of insert DNA in ng/μL
10    insert_length (float): Length of insert DNA in base pairs
11    molar_ratio (float): Desired molar ratio of insert:vector
12    total_volume (float): Total reaction volume in μL
13    vector_amount (float): Amount of vector DNA to use in ng (default: 50)
14    
15    Returns:
16    dict: Dictionary containing calculated volumes and amounts
17    """
18    # Calculate vector volume
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calculate required insert amount
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calculate insert volume
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calculate buffer/water volume
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Example usage
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convert lengths to kb for calculation
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calculate required insert amount
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calculate volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Example usage
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convert lengths to kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calculate required insert amount
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calculate volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Round to 2 decimal places
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convert lengths to kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calculate required insert amount
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calculate volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Round to 2 decimal places
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Frequently Asked Questions (FAQ)

What is the optimal molar ratio for DNA ligation?

Optimalno molarno razmerje vstavka in vektorja običajno variira med 3:1 in 5:1 za standardne klonirne aplikacije. Vendar pa se to lahko razlikuje glede na specifičen ligacijski scenarij:

• Za blunt-end ligacije: 3:1 do 5:1
• Za sticky-end ligacije: 1:1 do 3:1
• Za velike vstavke (>10 kb): 1:1 do 2:1
• Za majhne vstavke (<500 bp): 5:1 do 10:1
• Za sestavljanje več fragmentov: 3:1 za vsak vstavek do vektorja

Why is my ligation reaction failing despite using the calculated volumes?

Več dejavnikov lahko vpliva na učinkovitost ligacije poleg molarnega razmerja:

1. Kakovost DNA: Preverite, ali imata tako vektor kot vstavek čiste konce brez poškodb
2. Defofosforilacija: Preverite, ali je bil vaš vektor defosforiliran, kar preprečuje samo-ligacijo
3. Aktivnost encima: Preverite, ali je vaša ligaza aktivna in uporabljena pri pravilni temperaturi
4. Čas inkubacije: Nekatere ligacije koristijo daljšo inkubacijo (čez noč pri 16°C)
5. Pogoji puferja: Preverite, ali se uporablja pravilen pufer z ATP
6. Kontaminanti: Očistite DNA, da odstranite inhibitorje, kot so EDTA ali visoka sol

How much vector DNA should I use in a ligation reaction?

Običajno se priporoča 50-100 ng vektorske DNA za standardne ligacijske reakcije. Uporaba preveč vektorja lahko privede do višjega ozadja neprekinjenega ali samo-ligiranega vektorja, medtem ko lahko premajhna količina zmanjša učinkovitost transformacije. Za izzivne ligacije boste morda morali optimizirati to količino.

Should I adjust calculations for blunt-end versus sticky-end ligations?

Da. Blunt-end ligacije so običajno manj učinkovite kot sticky-end (kohezivne) ligacije. Za blunt-end ligacije uporabite:

• Višja molarna razmerja (3:1 do 5:1 ali še višja)
• Več T4 DNA ligaze (običajno 2-3 krat več)
• Daljši čas inkubacije
• Razmislite o dodajanju PEG za povečanje učinkovitosti ligacije

How do I calculate ligation for multiple inserts?

Za sestavljanje več fragmentov:

1. Posamezno izračunajte količine vsakega vstavka z uporabo iste formule
2. Ohranite isto skupno molarno razmerje (npr. za dva vstavka uporabite 1.5:1.5:1 vstavek1:vstavek2:vektor)
3. Prilagodite skupni volumen reakcije, da vključite vse DNA fragmente
4. Razmislite o zaporedni ligaciji ali uporabi metod, kot je Gibson Assembly, za več fragmentov

Can I use this calculator for Gibson Assembly or Golden Gate Assembly?

Ta kalkulator je posebej zasnovan za tradicionalno ligacijo z restrikcijskimi encimi in ligazo. Za Gibson Assembly se običajno priporočajo ekvivalentne količine vseh fragmentov (1:1 razmerje), čeprav je osnovni izračun DNA količin na podlagi dolžine podoben. Za Golden Gate Assembly se običajno uporabljajo ekvivalentna razmerja vseh komponent.

How do I account for vector dephosphorylation in my calculations?

Defofosforilacija vektorja (odstranjevanje 5' fosfatnih skupin) preprečuje samo-ligacijo, vendar ne spremeni izračunov količin. Vendar pa za defosforilirane vektorje:

1. Uporabite svežo vstavljeno DNA z nedotaknjenimi 5' fosfati
2. Razmislite o uporabi nekoliko višjih razmerij vstavka:vektorja (4:1 do 6:1)
3. Preverite daljše čase ligacije (vsaj 1 uro pri sobni temperaturi ali čez noč pri 16°C)

What's the minimum total reaction volume I should use?

Minimalni praktični volumen reakcije je običajno 10 μL, kar omogoča ustrezno mešanje in preprečuje težave z izhlapevanjem. Če vaši izračunani DNA volumi presegajo želeni volumen reakcije, imate več možnosti:

1. Uporabite bolj koncentrirane DNA vzorce
2. Zmanjšajte količino vektorja, ki jo uporabite (npr. 25 ng namesto 50 ng)
3. Povečajte skupni volumen reakcije
4. Razmislite o koncentraciji vaših DNA vzorcev

How long should I incubate my ligation reaction?

Optimalni časi inkubacije se razlikujejo glede na vrsto ligacije:

• Sticky-end ligacije: 1 ura pri sobni temperaturi (22-25°C) ali 4-16 ur pri 16°C
• Blunt-end ligacije: 2-4 ure pri sobni temperaturi ali čez noč (12-16 ur) pri 16°C
• Hitre ligacije (z uporabo visoko koncentrirane ligaze): 5-15 minut pri sobni temperaturi

Can I reuse leftover ligation reaction for transformation?

Da, ligacijske mešanice se običajno lahko shranijo pri -20°C in ponovno uporabijo za transformacijo. Vendar pa lahko vsaka zamrznitev-odmrzovanje zmanjša učinkovitost. Za najboljše rezultate:

1. Aliquot mešanico ligacije pred zamrzovanjem
2. Segrejte ligazo (65°C za 10 minut) pred shranjevanjem
3. Uporabite v 1-2 mesecih za optimalne rezultate

References

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/