Kalkulator zaporednih razredčitev - Laboratorijsko orodje za koncentracijo

Kalkulator zaporednega redčenja določi koncentracijo snovi pri vsakem koraku serije redčenj. Zaporedno redčenje je laboratorijska tehnika, pri kateri se koncentracija raztopine zaporedoma zmanjšuje v enakih korakih, pri čemer vsak nov korak prejšnjega razredči z enakim faktorjem.

Kaj je zaporedno redčenje?

Zaporedno redčenje rešuje pogost laboratorijski problem: vzorec je preveč koncentriran, da bi ga lahko neposredno izmerili ali uporabili. Namesto merjenja zelo majhne prostornine, pri katerem je večja možnost napake, znanstvenik vzorec večkrat zaporedoma razredči ter pri vsakem koraku uporabi majhno in obvladljivo prostornino.

Vsako redčenje se začne z rezultatom prejšnjega koraka, ne z izvirnim vzorcem. Tako nastane niz koncentracij, ki se vsakič zmanjšajo za isti faktor. Tehnika se uporablja za štetje bakterij, preverjanje vpliva zdravila na celice pri različnih odmerkih, izdelavo umeritvenih krivulj za laboratorijske teste in pripravo vzorcev DNK za PCR.

Formula za zaporedno redčenje

Vsak korak redčenja sledi tej formuli:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ je koncentracija pred korakom
• DF je faktor redčenja
• C₂ je koncentracija po koraku

Za določitev koncentracije po več korakih hkrati uporabite:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ je začetna koncentracija
• DF je faktor redčenja
• n je število korakov
• C_n je koncentracija po n korakih

Faktor redčenja mora biti večji od 1. Faktor 1 ne bi pomenil nobenega redčenja. Začetna koncentracija mora biti večja od 0.

Ta kalkulator omogoča od 1 do 20 korakov in poleg njih navede tudi korak 0, torej nerazredčeni vzorec. Enota koncentracije je navadna besedilna oznaka, na primer mg/mL ali CFU/mL, vse vrstice pa so navedene v isti enoti. Koncentracije so prikazane na šest pomembnih mest, vrednosti pod 0,000001 pa so zapisane v znanstvenem zapisu, zato majhen rezultat ni nikoli prikazan kot nič.

Faktor redčenja v primerjavi z razmerjem redčenja

Faktor redčenja 10 se pogosto zapiše kot razmerje 1:10. Razmerje opisuje deleže, ne samega faktorja: 1 del vzorca in 9 delov razredčila tvori skupaj 10 delov. Faktor pove, kolikokrat manjša je koncentracija nove raztopine, zato je razmerje 1:10 faktor redčenja 10, ne 11.

Pogosti faktorji redčenja so:

• 10 (1:10): standardna izbira v mikrobiologiji, saj v nekaj korakih pokrije širok razpon koncentracij.
• 2 (1:2): pogosto v farmakologiji, kjer so za izris krivulje odziva na odmerek potrebni manjši koraki.
• 5 (1:5): vmesna možnost, ki zagotovi več podatkovnih točk kot 1:10, vendar manj korakov kot 1:2.

Primer: redčenje bakterijske kulture

Tekoča kultura vsebuje ocenjeno 10⁸ enot, ki tvorijo kolonije (CFU), na mililiter, zato je pregosta za neposredno štetje. Za štetje je potrebnih med 30 in 300 kolonij na ploščici, zato vzorec potrebuje serijo 1:10 s 6 koraki.

Nanos 100 μL (0,1 mL) iz koraka 5 na gojiščno ploščico nanese približno 10² = 100 CFU, kar je znotraj območja za štetje.

Primer: serija redčenja zdravila z dvakratnim redčenjem

Pričakuje se, da ima zdravilo IC50 (koncentracijo, ki za polovico zmanjša aktivnost) blizu 25 mg/mL. Preizkušanje razpona okoli te vrednosti zahteva serijo 1:2, ki se začne pri 100 mg/mL in ima 5 korakov.

Ta serija zajame pričakovani IC50 in zagotovi dovolj točk za izris krivulje odziva na odmerek.

Kako izvedemo zaporedno redčenje

1. Pred začetkom označite vsako epruveto s številko koraka in faktorjem redčenja.
2. V vsako epruveto, razen v tisto z izvirnim vzorcem, dodajte razredčilo. Pri seriji 1:10 dodajte 9 prostornin razredčila k 1 prostornini, v katero boste dodali vzorec.
3. Odmerjeno prostornino izvirnega vzorca prenesite v prvo epruveto in jo temeljito premešajte, bodisi z vrtinčenjem bodisi z večkratnim pipetiranjem navzgor in navzdol.
4. Z novo konico prenesite enako prostornino iz prve epruvete v drugo epruveto in jo ponovno premešajte.
5. Korak prenosa in mešanja ponovite za vsako preostalo epruveto.
6. Razredčene vzorce uporabite čim prej, saj žive celice še naprej rastejo, nekatere spojine pa se sčasoma razgradijo.

Kje se uporablja zaporedno redčenje

V mikrobiologiji se zaporedno redčenje uporablja za štetje kolonij bakterij na gojiščnih ploščicah in za testiranje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), pri katerem se določi najnižji odmerek antibiotika, ki ustavi rast bakterij. V biokemiji se uporablja za izdelavo standardnih krivulj pri analizah beljakovin in za pripravo predlog DNK za PCR pri uporabni koncentraciji. V farmakologiji se serije redčenj uporabljajo za preizkušanje zdravil v razponu odmerkov in za izračun vrednosti, kot je IC50. V imunologiji se uporabljajo za umeritvene krivulje ELISA in za titracijo protiteles, pri kateri se določi največje redčenje, ki še daje pozitiven rezultat.

Pogoste napake

Slabo mešanje posamezne epruvete je pogost vir napak, saj se lahko delci in celice usedejo, namesto da bi ostali enakomerno porazdeljeni. Ponovna uporaba pipetne konice lahko prenese dovolj materiala iz bolj koncentrirane epruvete, da vpliva na poznejše meritve. Zamenjava razmerja redčenja s faktorjem redčenja vodi do napačnih prostornin: redčenje 1:10 pomeni 1 del vzorca in 9 delov razredčila, ne 1 dela in 10. Če koncentracijo zaokrožimo pri vsakem koraku, namesto da bi končno vrednost neposredno izračunali iz C₀/DF^n, se lahko napaka v več korakih opazno poveča.

Zgodovina

Robert Koch je v 1880. letih pri preučevanju tuberkuloze in kolere razvil kvantitativne metode za štetje bakterijskih kolonij ter s tem postavil temelje metode štetja kolonij na gojiščnih ploščicah, ki se uporablja še danes. Mikropipeta z zračno blazinico, ki jo je Heinrich Schnitger izumil leta 1957, je raziskovalcem pozneje omogočila natančno merjenje mikrolitrskih prostornin, kar je omogočilo izvedbo finih in ponovljivih serij redčenj v molekularni biologiji in imunskih testih.

Pogosta vprašanja

Kako izračunate zaporedno redčenje? Uporabite C_n = C₀ / DF^n, pri čemer je C₀ začetna koncentracija, DF faktor redčenja, n pa število korakov. Na primer, pri redčenju 100 mg/mL s faktorjem 10 v 3 korakih dobimo 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Kakšna je razlika med faktorjem redčenja in razmerjem redčenja? Razmerje redčenja, na primer 1:10, opisuje deleže: 1 del vzorca se zmeša z 9 deli razredčila, kar da skupaj 10 delov. Faktor redčenja je samo število 10, kar pomeni, da je raztopina desetkrat manj koncentrirana.

Zakaj uporabiti več majhnih korakov redčenja namesto enega velikega? Prenose majhnih in enakih prostornin je lažje natančno pipetirati kot eno zelo veliko redčenje. Serija šestih korakov 1:10 doseže tudi milijonkratno redčenje, kar je v enem samem koraku težko natančno izvesti.

Kako natančno je zaporedno redčenje? S kalibriranimi pipetami in skrbno izvedbo je serija običajno natančna na 5 do 10 odstotkov, kar ustreza večini mikrobioloških opravil. Pri postopkih, ki zahtevajo večjo natančnost, na primer pri farmacevtskih standardih, se pogosto uporabljajo vzporedna redčenja, pripravljena neposredno iz osnovne raztopine.

Koliko korakov redčenja je največ smiselno uporabiti? Ta kalkulator omogoča največ 20 korakov. Večina laboratorijskih protokolov uporablja 6 do 10 korakov, saj se napaka poveča z vsakim dodatnim prenosom. Večji faktor redčenja zmanjša potrebno število korakov; trije koraki 1:100 na primer dosežejo enako redčenje 10⁻⁶ kot šest korakov 1:10.

Ali se lahko faktor redčenja med koraki iste serije spremeni? Da, vendar večina protokolov ohranja enak faktor, saj je stalni faktor lažje izračunati, ga pipetirati in ponoviti. Serija s spreminjajočim se faktorjem se občasno uporablja, kadar je za en del razpona koncentracij potrebna večja ločljivost kot za drugega.