Kalkulator redčenja celic - Natančno orodje za laboratorijsko redčenje

Kalkulator redčenja celične suspenzije

Kalkulator redčenja celične suspenzije izračuna, koliko celične suspenzije in koliko razredčila je treba zmešati, da se v izbranem končnem volumnu doseže ciljna koncentracija celic. Uporablja se pri gojenju celic, v mikrobiologiji in drugem laboratorijskem delu, pri katerem je treba vzorec pred uporabo pripraviti na natančno koncentracijo.

Kaj pomeni redčenje celic

Z redčenjem celične suspenzije se število celic v njej ne spremeni. Spremeni se le volumen tekočine, v katerem so celice, zato se koncentracija zmanjša. Suspenzija, pri kateri je izmerjenih 1.000.000 celic na mililiter (celic/mL), ima po redčenju še vedno enako skupno število celic. To število je le porazdeljeno v večji količini tekočine.

V laboratorijih se celice redčijo pred številnimi rutinskimi postopki: pred prenosom dela rastoče kulture v nove erlenmajerice, nanosom določenega števila celic v vsako jamico ploščice, zamrzovanjem celic za shranjevanje ali pripravo vzorca za celični števec oziroma pretočni citometer.

Formula za redčenje celic

Izračun temelji na enem pravilu. Število celic, odvzetih iz osnovne suspenzije, pomnoženo z njihovo koncentracijo, mora biti enako številu celic v končnem volumnu, pomnoženemu s ciljno koncentracijo:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — začetna koncentracija (koncentracija osnovne suspenzije), v celicah/mL
• V₁ — volumen osnovne suspenzije, ki ga je treba uporabiti, v mL
• C₂ — ciljna koncentracija, v celicah/mL
• V₂ — potrebni skupni končni volumen, v mL

Če izraz preoblikujemo za V₁, dobimo volumen osnovne suspenzije, ki ga je treba odpipetirati:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Preostanek končnega volumna predstavlja razredčilo, običajno celično gojišče, s fosfatom pufrana fiziološka raztopina (PBS) ali drug pufer:

Volumen razredčila = V₂ − V₁

Ciljna koncentracija (C₂) nikoli ne more biti višja od koncentracije osnovne suspenzije (C₁). Redčenje koncentracijo samo zmanjša. Za njeno povečanje je treba celice centrifugirati in jih resuspendirati v manjši količini tekočine.

Kako izračunati redčenje celic

1. Osnovno suspenzijo preštejte s hemocitometrom ali avtomatskim celičnim števcem, da dobite C₁.
2. Zabeležite ciljno koncentracijo, C₂, ki jo zahteva protokol.
3. Določite potrebni skupni končni volumen, V₂.
4. Izračunajte V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Izračunajte volumen razredčila kot V₂ − V₁.
6. V epruveto odpipetirajte V₁ osnovne suspenzije, nato dodajte ustrezen volumen gojišča ali pufra.

Izračunani primer

V osnovni suspenziji je izmerjenih 1.000.000 celic/mL. Protokol zahteva 100.000 celic/mL v končnem volumnu 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volumen razredčila = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Če vzamemo 1 mL osnovne suspenzije in dodamo 9 mL gojišča, dobimo 10 mL suspenzije s koncentracijo 100.000 celic/mL.

Drugi primer

Test na ploščici z 96 jamicami zahteva 10.000 celic na jamico v 200 mikrolitrih (μL) gojišča na jamico. To je ciljna koncentracija 50.000 celic/mL, saj je 10.000 celic, deljenih z 0,2 mL, enako 50.000 celic/mL. V osnovni suspenziji je izmerjenih 2.000.000 celic/mL, za pokritje ploščice pa je potrebnih 20 mL skupnega volumna, z nekaj rezerve zaradi izgub pri pipetiranju.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volumen razredčila = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Če zmešamo 0,5 mL osnovne suspenzije z 19,5 mL gojišča, dobimo 20 mL s koncentracijo 50.000 celic/mL, kar je redčenje 1 proti 40.

Viri napak

Sama formula je natančna. Napake izvirajo iz števil, vnesenih vanjo.

• Napaka pri štetju. Napačno prešteto število celic neposredno povzroči napačno redčenje. Tveganje se zmanjša, če se preštejejo vsi štirje vogalni kvadratki mreže hemocitometra in izračuna njihovo povprečje.
• Zlepljene celice. Skupina celic je pod mikroskopom videti kot ena celica, v resnici pa jih je več, zato navidezno zmanjša koncentracijo.
• Območje pipete. Pipeta, uporabljena zunaj svojega nazivnega volumskega območja, daje nenatančne rezultate. Pipeta za 1000 μL, nastavljena na izdajanje 5 μL, ni zanesljiva; namesto nje je treba uporabiti manjšo pipeto.
• Zamenjava enot. Mešanje enot celic/mL in celic/μL povzroči napako, ki je tisočkrat prevelika ali premajhna.
• Mrtve celice. Surovo štetje celic vključuje tudi mrtve celice, razen če je bilo uporabljeno barvilo za ugotavljanje viabilnosti, na primer tripansko modrilo. Zato je lahko število dejansko prisotnih živih celic precenjeno.

Omejitve tega kalkulatorja

Kalkulator zavrne številke, za katere ne more dati uporabnega odgovora:

• Vsaka vrednost mora biti večja od nič.
• Ciljna koncentracija ne sme biti višja od začetne koncentracije.
• Začetna koncentracija mora biti največ 1 bilijon celic/mL (1 × 10¹²).
• Izračunani volumen osnovne suspenzije mora znašati najmanj 0,001 mL, kar ustreza 1 mikrolitru. Manjšega volumna ni mogoče natančno odpipetirati, zato kalkulator zahteva druge vrednosti. To se običajno odpravi s povečanjem skupnega volumna.

Volumni so prikazani na dve decimalni mesti oziroma na tri, kadar je volumen osnovne suspenzije manjši od 0,01 mL, zato majhen volumen ni nikoli prikazan kot 0,00 mL.

Pogosta vprašanja

Kakšna je formula za redčenje celic?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, pri čemer sta C₁ in C₂ začetna in ciljna koncentracija, V₁ in V₂ pa volumen, odvzet iz osnovne suspenzije, in skupni končni volumen.

Ali je lahko ciljna koncentracija višja od začetne koncentracije?

Ne. Redčenje koncentracijo samo zmanjša. Za doseganje višje koncentracije je treba celice centrifugirati in jih resuspendirati v manjšem volumnu.

Katero tekočino je treba uporabiti za redčenje celic?

Celotno gojišče za celice se uporablja, kadar morajo celice ostati zdrave več ur ali dni, na primer pred nanosom na ploščico. PBS ali podobna pufrana fiziološka raztopina je primerna za kratkotrajno redčenje, krajše od približno 30 minut, preden se celice nadalje obdelajo. Gojišče brez seruma se uporablja, kadar bi serumske beljakovine motile nadaljnji test.

Ali ta formula deluje za bakterije ali kvasovke?

Da. C₁V₁ = C₂V₂ velja za vsako suspenzijo delcev, vključno z bakterijami, merjenimi v enotah, ki tvorijo kolonije, na mililiter (CFU/mL), kvasovkami in virusnimi delci, merjenimi v plakotvornih enotah na mililiter (PFU/mL), če so na obeh straneh enačbe uporabljene iste enote.

Ali je treba pri redčenju šteti mrtve celice?

Pri nacepljanju žive kulture se štejejo samo vitalne celice. Če je suspenzija 80 % vitalna, je njena koncentracija vitalnih celic 0,8-kratnik skupnega števila celic, ta koncentracija pa se uporabi kot C₁.

Kako je mogoče zelo velika redčenja izvesti natančno?

Velika redčenja, na primer 1 proti 1000, se običajno izvedejo v nizu manjših korakov, imenovanem serijsko redčenje. Tri zaporedna redčenja 1 proti 10 skupaj dosežejo redčenje 1 proti 1000, pri tem pa vsak korak pipetiranja ostane znotraj natančnega volumna.