Beer-Lambertov zakon - Trenutno izračunavanje apsorbancije

Шта је Беров–Ламбертов закон?

Закон Бера—Ламберта је формула која описује колико светлости раствор апсорбује. Повезује апсорбанцу са три величине: концентрацијом раствора, јачином апсорпције светлости растворене супстанце и растојањем које светлост прелази кроз узорак. Назива се и Беров закон. Калкулатор за закон Бера—Ламберта примењује ову формулу да из неколико једноставних улазних података израчуна апсорбанцу, трансмитансу и проценат апсорбоване светлости.

Закон је основно средство у спектроскопији, науци о томе како материја апсорбује и емитује светлост. Свакодневно се користи у хемијским, биолошким и медицинским лабораторијама за мерење концентрације супстанци у раствору.

Формула Беров–Ламбертовог закона

Закон Бера—Ламберта гласи:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A је апсорбанца, односно количина светлости коју раствор апсорбује на датој таласној дужини. Нема јединицу.
• ε (епсилон) је моларна апсорптивност, која се назива и моларни коефицијент екстинкције. Она мери колико снажно супстанца апсорбује светлост на одређеној таласној дужини. Јединице: L/(mol·cm).
• c је концентрација супстанце, изражена у моловима по литру (моларност).
• l је дужина оптичког пута, односно растојање које светлост прелази кроз узорак, у cm.

Апсорбанца је повезана са трансмитансом, уделом светлости који пролази кроз узорак:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Овде је T трансмитанса, број између 0 и 1. Множењем T са 100 добија се проценат пропуштене светлости. Проценат апсорбоване светлости је:

$\text{Проценат апсорбоване светлости} = (1 - T) \times 100\%$

На пример, апсорбанца од 1,0 значи да је T = 0,1, па је апсорбовано 90% светлости. Апсорбанца од 2,0 значи да је T = 0,01, па је апсорбовано 99% светлости.

Како израчунати апсорбанцу

Да би се апсорбанца израчунала помоћу калкулатора, уносе се три вредности:

1. Дужина оптичког пута (l) — ширина посуде за узорак, обично кивете. Већина стандардних кивета широка је 1 cm, мада су неке специјализоване кивете широке 0,1 cm или 10 cm.
2. Моларна апсорптивност (ε) — својство одређене супстанце на одређеној таласној дужини. Обично се налази у објављеним референтним табелама или израчунава на основу структуре молекула. На пример, протеини апсорбују светлост око 280 nm због две аминокиселине, триптофана и тирозина, а тачна вредност зависи од њиховог броја у протеину.
3. Концентрација (c) — количина растворене супстанце, у mol/L. Концентрације дате у другим јединицама, као што је mg/mL, најпре се морају претворити помоћу моларне масе молекула.

Калкулатор множи те три вредности да би добио апсорбанцу, а затим из тог резултата изводи трансмитансу и проценат апсорбоване светлости.

Решени пример

Истраживач пречишћава протеин и треба да провери његову концентрацију пре извођења експеримента. Моларна апсорптивност протеина на 280 nm позната је на основу његове секвенце: ε = 44.000 L/(mol·cm). Истраживач мери узорак у стандардној кивети од 1 cm и очитава апсорбанцу A = 0,523.

Преуређивањем формуле да би се изразила концентрација:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

То износи 11,9 микромола (μM). Ова вредност је у опсегу у којем инструменти најпрецизније очитавају, па истраживач може да јој верује без додатног разблаживања узорка.

Тумачење вредности апсорбанце

• A = 0: на овој таласној дужини није апсорбована светлост.
• A = 0,3 до 0,9: опсег у којем већина спектрофотометара даје најпрецизнија, линеарна очитавања.
• A = 1,0: апсорбовано је 90% светлости, а пропуштено 10%.
• A = 2,0: апсорбовано је 99% светлости, а пропуштено 1%.
• A изнад 2,5: изван поузданог опсега већине инструмената. Узорак треба разблажити и поново измерити.

На очитавања испод приближно 0,3 утиче шум инструмента. На очитавања изнад приближно 1,5 утичу мале количине расуте светлости унутар инструмента, што уноси грешку. Разблаживање узорка и поновно мерење стандардни су поступак када очитавање изађе изван прецизног опсега.

Примене Беров–Ламбертовог закона

Аналитичка хемија. Лабораторије мере апсорбанцу узорка и користе формулу за израчунавање непознате концентрације уназад. То је уобичајено при испитивању нивоа нитрата, фосфата и јона метала у води, као и при провери концентрације хемијске серије током производње.

Биохемија. Апсорбанца на 280 nm процењује концентрацију протеина. Апсорбанца на 260 nm процењује концентрацију ДНК или РНК; по конвенцији, апсорбанца од 1,0 одговара приближно 50 μg/mL дволанчане ДНК или 40 μg/mL РНК. Однос два очитавања (A260/A280) даје грубу меру чистоће узорка.

Фармацеутска индустрија. Произвођачи лекова користе очитавања апсорбанце за испитивање брзине ослобађања активне супстанце из таблете и за праћење разградње лека током складиштења.

Медицина. Многи аутоматизовани уређаји за анализу крви мере апсорбанцу на основу хемијских реакција које мењају боју, како би одредили ниво глукозе, јетрених ензима и билирубина.

Храна и пиће. Боја пива мери се апсорбанцом на 430 nm према методи Европске конвенције пива (EBC). Сличне методе проверавају боју вина и безалкохолних пића.

Ограничења Беров–Ламбертовог закона

Закон претпоставља да је светлост једне, прецизно одређене таласне дужине и да узорак не расипа светлост. Он не важи у неколико уобичајених ситуација:

• Висока концентрација. Изнад приближно 0,01 mol/L растворени молекули почињу да међусобно делују, па апсорбанца престаје да расте линеарно са концентрацијом.
• Мутни узорци или узорци са честицама. Суспензије и мутне течности расипају светлост поред тога што је апсорбују, чиме се очитана апсорбанца повећава. Закон Бера—Ламберта не узима у обзир расипање; за непрозирне узорке или узорке који расипају светлост, као што су прахови, користи се сродни модел, Кубелка—Мункова теорија.
• Хемијске промене током мерења. Неке супстанце се разграђују под дејством светлости или мењају облик са променом pH током мерења, што мења очитавање у току мерења.
• Промене температуре. Моларна апсорптивност зависи од температуре, па очитавања добијена на различитим температурама нису непосредно упоредива.

Историја

Закон се развијао више од једног века кроз рад тројице научника. Пјер Буге је у делу из 1729 описао како сваки једнаки слој материјала апсорбује једнак удео светлости која пролази кроз њега. Јохан Хајнрих Ламберт је ову везу математички поново формулисао у својој књизи Photometria из 1760, показавши да апсорбанца расте директно сразмерно дужини оптичког пута. Август Бер је у 1852 проширио закон, показавши да апсорбанца такође расте директно сразмерно концентрацији. Обједињени закон се понекад назива Буге—Бер—Ламбетов закон, у знак признања свој тројици.

Најчешће постављана питања

За шта се користи закон Бера—Ламберта? Он израчунава колико светлости раствор апсорбује, а може се користити и обрнуто, за одређивање непознате концентрације на основу измерене апсорбанце. Зато је основа UV-Vis спектрофотометрије, уобичајене лабораторијске технике за мерење количине супстанце у раствору.

Које јединице користи закон Бера—Ламберта? Дужина оптичког пута изражава се у центиметрима, моларна апсорптивност у L/(mol·cm), а концентрација у mol/L. Апсорбанца сама нема јединицу, мада се понекад означава са „AU“, за јединице апсорбанце. Уношење других јединица у формулу без претходног претварања даје погрешан резултат.

Зашто моје очитавање апсорбанце није сразмерно концентрацији? Најчешћи узроци су концентрација изнад приближно 0,01 mol/L, мутан узорак или узорак са честицама, или очитавање далеко изван опсега 0,3–0,9 у којем су инструменти најпрецизнији. Разблаживање узорка и поновно мерење обично потврђују који је узрок у питању.

Која је разлика између апсорбанце и трансмитансе? Трансмитанса је удео светлости који пролази кроз узорак. Апсорбанца је негативни логаритам трансмитансе са основом 10: A = −log₁₀(T). Са порастом апсорбанце трансмитанса опада.

Која је разлика између апсорбанце и оптичке густине? То је иста величина. Израз „оптичка густина“ чешће се користи у биологији, док је „апсорбанца“ уобичајенија у хемији.

Који опсег апсорбанце је најпрецизнији? Приближно 0,3 до 0,9. Испод тог опсега шум инструмента доминира сигналом. Изнад приближно 1,5 расута светлост унутар инструмента уноси грешку, а изнад приближно 2,5 већина инструмената уопште не може да да поуздано очитавање.

Литература

1. Беер, А. (1852). „Одређивање апсорпције црвене светлости у обојеним течностима.“ Анали физике и хемије, 86: 78–88.
2. Свајнхарт, Д. Ф. (1962). „Беров–Ламбертов закон.“ Часопис за хемијско образовање, 39(7): 333–335.
3. Мајерхефер, Т. Г., Палов, С. и Поп, Ј. (2020). „Бугер–Беров–Ламбертов закон: осветљавање нејасног.“ ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.