Калкулатор калибрационе криве | Линеарна регресија за лабораторијску анализу

Шта је калкулатор калибрационе криве

Калкулатор калибрационе криве претвара очитавања инструмента у концентрације. То ради тако што прилагођава праву кроз тачке података добијене од стандарда познате концентрације, а затим ту праву користи за претварање новог очитавања у концентрацију. Лабораторије користе калибрационе криве у хемији, биологији и испитивању животне средине кад год инструмент пријављује сигнал, као што су апсорбанца или површина пика, уместо саме концентрације.

Калкулатор на овој страници прилагођава праву методом линеарне регресије, односно методом најмањих квадрата. Приказује нагиб, одсечак и Р², меру блискости тачака правој. Затим може да процени концентрацију непознатог узорка на основу измереног одзива.

Формула калибрационе криве

Калибрациона крива претпоставља линеарну зависност између концентрације и одзива инструмента:

$y = mx + b$

• $y$ је одзив (оно што инструмент мери)
• $x$ је концентрација
• $m$ је нагиб
• $b$ је одсечак на y-оси

Како израчунати нагиб и одсечак

За скуп од $n$ тачака, нагиб и одсечак који најбоље описују податке (у смислу методе најмањих квадрата) јесу:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Овде су $\bar{x}$ и $\bar{y}$ средња концентрација и средњи одзив свих тачака.

Формула за Р²

Р², коефицијент детерминације, показује колико добро права одговара подацима:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ је одзив који права предвиђа за сваки $x_i$. Р² има вредност од 0 до 1. Вредност 1 значи да свака тачка лежи тачно на правој.

Формула за непознату концентрацију

Кад су нагиб и одсечак познати, измерени одзив $y$ може се поново претворити у концентрацију:

$x = \frac{y - b}{m}$

Ако се овим израчунавањем добије негативан број, калкулатор приказује концентрацију као 0, јер негативна концентрација нема физички смисао. Такође приказује 0 када је прилагођени нагиб 0, јер хоризонтална права не садржи информацију о концентрацији.

Решени пример

Претпоставимо да четири стандарда дају следеће резултате:

Средња концентрација је 3, а средњи одзив је 0,20.

Нагиб:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Одсечак:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

Р²: поређењем предвиђених и стварних одзива добија се Р² = 0,9966.

Прилагођена права је:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Сада претпоставимо да непознати узорак даје одзив 0,20. Његова концентрација је:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Како се користи овај калкулатор

1. Унесите познату концентрацију сваког стандарда и његов измерени одзив као пар бројева. Калкулатор почиње са два реда.
2. Изаберите „Додај тачку података“ да бисте унели још стандарда или „Уклони тачку података“ поред реда да бисте је обрисали. Потребне су најмање две тачке.
3. Када су попуњене најмање две тачке, калкулатор приказује регресиону једначину, вредност Р² и график тачака са прилагођеном правом. Нагиб, одсечак, Р² и концентрација за приказ се заокружују на четири децимале.
4. Унесите измерени одзив у одељак „Израчунајте непознату концентрацију“ да бисте видели одговарајућу концентрацију. Вредност се аутоматски ажурира док је уносите; нема посебног дугмета које треба притиснути.
5. Изаберите „Ресетуј“ да бисте обрисали све унете тачке и поље за одзив и почели изнова.

Тумачење нагиба, одсечка и Р²

Нагиб показује колико се одзив мења по јединици концентрације. Већи нагиб значи да метода снажно реагује на мале промене концентрације.

Одсечак је предвиђени одзив при нултој концентрацији. Он одражава сигнал позадине, као што су сигнал слепе пробе или основна линија инструмента. Ненула одсечка је уобичајена и сама по себи није проблем, али велики или непостојан одсечак између калибрација може указивати на контаминацију или квар инструмента.

Р² показује колико тачке прате праву линију. Вредности изнад 0,99 уобичајене су за добро функционишућу линеарну методу. Нижа вредност Р² може указивати на грешку при пипетирању, деградирани стандард или опсег концентрација у којем одзив више није линеаран.

Где се користе калибрационе криве

Калибрационе криве су уобичајене свуда где сирови сигнал инструмента треба претворити у концентрацију:

• Спектрофотометрија — мери се апсорбанца светлости и претвара у концентрацију, на пример при мерењу садржаја протеина или пигмента.
• Хроматографија (ХПЛЦ, ГХ) — површина или висина пика на хроматограму претвара се у концентрацију, што је уобичајено при испитивању лекова и анализи животне средине.
• ЕЛИСА и други имуноесеји — интензитет боје или флуоресценције који очитава читач плоча претвара се у концентрацију антигена или антитела.
• кПЦР — вредности прага циклуса из серијских разблажења познатог узорка граде криву која се користи за процену количине генетичког материјала у непознатом узорку.

Када права линија не одговара подацима

Неке методе нису линеарне у целом опсегу. Уобичајена решења су ограничавање калибрације на ужи, линеарни део, примена логаритамске трансформације пре прилагођавања праве, коришћење полиномског прилагођавања (криве) или употреба пондерисане регресије када се грешка мерења повећава или смањује са концентрацијом. Овај калкулатор прилагођава само праву линију; ако тачке очигледно образују криву, резултати ће бити мање поуздани и можда ће бити потребан други модел.

Најчешће постављана питања

Шта је калибрациона крива?

Калибрациона крива је права прилагођена очитавањима инструмента за узорке познате концентрације. Користи се за претварање новог очитавања узорка непознате концентрације у вредност концентрације.

Колико је тачака података потребно за калибрациону криву?

Калкулатору су потребне најмање две тачке за прилагођавање праве, али две тачке не могу показати да ли је стварна зависност заиста права. Већина лабораторија користи пет до осам стандарда који обухватају очекивани опсег концентрација непознатих узорака.

Шта значи Р² у калибрационој кривој?

Р² мери колико тачке података прате прилагођену праву, на скали од 0 до 1. Вредност 1 значи да свака тачка лежи тачно на правој. Вредности изнад 0,99 обично се сматрају снажним доказом линеарне зависности.

Да ли се концентрације могу процењивати ван опсега стандарда?

Процена концентрације испод најнижег или изнад највишег стандарда није поуздана, јер нема података који потврђују да права и тамо остаје права. Боље је разблажити узорак чије је очитавање превисоко или концентровати онај чије је очитавање прениско, па поновити мерење унутар калибрисаног опсега.

Зашто се израчуната концентрација понекад приказује као 0?

Ако је измерени одзив нижи од прилагођеног одсечка (уз позитиван нагиб), формула $x = (y - b) / m$ даје негативан број. Калкулатор у том случају приказује 0, јер стварна концентрација не може бити негативна. Такође приказује 0 када је нагиб 0, што се дешава ако сваки стандард има исти одзив или ако сваки стандард има исту концентрацију.

Која је разлика између нагиба и одсечка?

Нагиб описује осетљивост одзива на промену концентрације. Одсечак је одзив предвиђен при нултој концентрацији и често одражава сигнал позадине, а не самог аналита.