Калкулатор броја копија ДНК | Геномски алат за анализу

Калкулатор броја копија ДНК

Калкулатор броја копија ДНК процењује колико копија циљне секвенце постоји у узорку ДНК. Ради на основу концентрације и запремине узорка, као и учесталости појављивања циљне секвенце унутар дуже секвенце ДНК. Лабораторије молекуларне биологије користе ову врсту процене за планирање експеримената, као што је qPCR (квантитативна ланчана реакција полимеразе), пре извођења скупљег и прецизнијег теста.

Шта значи број копија ДНК

Број копија ДНК представља број појављивања одређене секвенце у геному или узорку. Типичан људски ген појављује се два пута, по једном од сваког родитеља. Тај број могу променити различити фактори.

• Амплификација: више од две копије. Ћелије рака често умножавају гене који подстичу раст, као што је HER2 у неким туморима дојке.
• Делеција: мање од две копије, понекад ниједна. Делеције могу изазвати генетске поремећаје.
• Дупликација: појављује се додатна копија тамо где би требало да постоји само једна или две.
• Варијација броја копија (CNV): нормална разлика у броју копија између појединаца, присутна у значајном делу људског генома.

Формула за број копија ДНК

Калкулатор претвара број појављивања секвенце и масу узорка у број копија помоћу следеће формуле:

$\text{Број копија} = \frac{\text{Број појављивања} \times \text{Концентрација} \times \text{Запремина} \times N_A}{\text{Дужина ДНК} \times 660 \times 10^{9}}$

Где:

• Број појављивања — колико се пута циљна секвенца појављује у целој секвенци ДНК, при чему се преклапајућа поклапања броје засебно.
• Концентрација — концентрација ДНК у нанограмима по микролитру (ng/μL), која се обично очитава спектрофотометром или флуорометром.
• Запремина — запремина узорка у микролитрима (μL).
• $N_A$ — Авогадров број, 6,022 × 10²³ молекула по молу. Он претвара количину ДНК изражену у моловима у број молекула.
• Дужина ДНК — дужина целе секвенце ДНК, изражена у паровима база.
• 660 — просечна молекулска маса једног пара база ДНК, у грамима по молу (g/mol). Пар база чине два упарена нуклеотида, по један из сваког ланца ДНК.
• 10⁹ — претвара нанограме у граме.

Формула најпре претвара масу узорка у молове молекула ДНК, затим је множи Авогадровим бројем да би добила укупан број молекула ДНК у узорку, а потом тај број множи бројем појављивања циљне секвенце у сваком молекулу.

Алат прихвата само слова A, T, C и G. Размаци и преломи редова се занемарују, а мала и велика слова се рачунају исто.

Како израчунати број копија ДНК: пример са поступком

Узмимо ДНК секвенцу од 12 парова база, ATCGATCGATCG, са циљном секвенцом ATCG, концентрацијом од 10 ng/μL и запремином од 20 μL.

Корак 1: Пребројте појављивања. ATCG се појављује 3 пута у ATCGATCGATCG, на позицијама 1, 5 и 9.

Корак 2: Одредите укупну масу ДНК. Концентрација × запремина = 10 × 20 = 200 ng.

Корак 3: Претворите у молове. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Поделите са (12 парова база × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Добија се 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Корак 4: Претворите у број молекула. Помножите са Авогадровим бројем: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ молекула/mol ≈ 1,52 × 10¹³ молекула ДНК.

Корак 5: Помножите бројем појављивања. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, односно око 45.621.212.121.212 копија.

Овај број делује огромно зато што узорак од 20 μL са 10 ng/μL и даље садржи билионе кратких молекула ДНК. У стварним узорцима обично се користе знатно дуже секвенце, што смањује број молекула при истој маси.

Где се користи анализа броја копија ДНК

Дијагностика рака. Патолошке лабораторије проверавају број копија HER2 у ткиву тумора дојке. Нормална ћелија носи две копије. Амплификовани тумор може носити шест или више копија, што утиче на подобност за циљане лекове као што је трастузумаб.

Тестирање генетских болести. Стања као што је Диџорџов синдром подразумевају делецију сегмента хромозома. Даунов синдром подразумева додатну копију хромозома 21 (тризомија 21). Пребројавање копија помаже у потврђивању ових дијагноза.

Квантификација трансгена и плазмида. Истраживачи проверавају колико је копија унетог гена доспело у биљну, животињску или бактеријску ћелију. Обично се преферира једна копија, јер више копија може подстаћи ћелију да утиша ген.

Праћење патогена и вирусног оптерећења. Процене броја копија прате количину вирусне или бактеријске ДНК присутне у узорку, што се користи за праћење инфекција и испитивање животне средине.

Друге методе за мерење броја копија

Овај калкулатор даје брзу процену на основу података о секвенци и концентрацији. Лабораторије којима је потребна већа прецизност обично користе једну од следећих метода:

• Квантитативна PCR (qPCR): умножава и мери ДНК у реалном времену; уз добру калибрациону криву, тачност је приближно 15–20%.
• Дигитална PCR (dPCR): дели узорак на хиљаде сићушних реакција ради директног пребројавања, без потребе за калибрационом кривом.
• Флуоресцентна хибридизација in situ (FISH): визуелно пребројава секвенце под микроскопом, директно на ћелијама или хромозомима; стандардна је метода у многим лабораторијама за дијагностику рака.
• Секвенцирање нове генерације (NGS): секвенцира цео узорак и истовремено одређује профил броја копија дуж целог генома.

Најчешће постављана питања

Шта је број копија ДНК? То је број појављивања одређене секвенце ДНК у геному или узорку. Већина људских гена појављује се два пута, по једном од сваког родитеља. Додатне копије или њихов недостатак могу утицати на здравље и ризик од болести.

Колико је овај калкулатор прецизан? Он даје теоријску процену на основу унетих података, а не лабораторијско мерење. Прецизност зависи од тачности мерења концентрације и специфичности циљне секвенце. Методе као што је дигитална PCR прецизније су за резултате који се објављују.

Да ли се овај калкулатор може користити за RNA? Не. RNA користи урацил уместо тимина и други шећер, па се њена молекулска маса разликује од молекулске масе ДНК. Просечна молекулска маса RNA износи око 330 g/mol по нуклеотиду, у поређењу са око 660 g/mol по пару база ДНК. Примена формуле за ДНК на податке о RNA дала би погрешан резултат.

Зашто се преклапајућа секвенца броји више пута? Калкулатор броји сваку позицију на којој се циљна секвенца поклапа, чак и када поклапања деле слова. У ATATAT, секвенца ATA поклапа се два пута, на позицији 1 и позицији 3, јер се свака почетна позиција проверава независно.

Који опсег концентрације ДНК даје најбоље резултате? Концентрације од 10–100 ng/μL дају најпоузданија очитавања на стандардним лабораторијским инструментима. Испод 10 ng/μL грешка мерења расте, па се уместо стандардног спектрофотометра препоручује осетљивија метода, као што је флуорометар.

Да ли овај калкулатор може да процени број копија плазмида? Да. Унесите целу секвенцу плазмида као секвенцу ДНК, а јединствени регион уметка као циљну секвенцу, заједно са измереном концентрацијом плазмида и запремином узорка.