Калкулатор концентрације протеина | A280 до mg/mL

Калкулатор концентрације протеина

Калкулатор концентрације протеина претвара очитавање апсорбанце светлости са спектрофотометра у количину протеина раствореног у раствору. Резултат се обично наводи у милиграмима по милилитру (mg/mL) или микрограмима по милилитру (μg/mL). Израчунавање се заснива на Беровом–Ламбертовом закону, односу у хемији који повезује количину светлости коју узорак апсорбује са количином супстанце коју садржи.

Како се мери концентрација протеина

Већина протеина снажно апсорбује ултраљубичасту светлост на таласној дужини од 280 нанометара (nm). За ову апсорпцију су углавном одговорне две аминокиселине, триптофан и тирозин, које се налазе у структури протеина. Спектрофотометар пропушта светлост кроз узорак и мери колики део те светлости узорак апсорбује. Ово очитавање се назива апсорбанца, или A280 када се мери на 280 nm.

Мерење апсорбанце на 280 nm је брзо и не уништава узорак. По томе се разликује од хемијских метода као што су Bradford и BCA тестови, описани у наставку. Метода најбоље функционише за пречишћен протеин у раствору, са очитавањем апсорбанце између приближно 0,1 и 1,0. Очитавања ван тог опсега су мање поуздана, па узорак често треба разблажити пре мерења.

Формула за концентрацију протеина

Калкулатор преуређује Беров–Ламбертов закон тако да израчуна концентрацију:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — концентрација протеина, у mg/mL
• A — апсорбанца на 280 nm (безименични број, без јединице)
• DF — фактор разблажења, број који показује колико је пута оригинални узорак разблажен пре мерења
• ε — коефицијент екстинкције, константа специфична за протеин, у L/(g·cm)
• l — дужина оптичког пута, растојање које светлост прелази кроз узорак, у cm (обично 1 cm у стандардној кивети, малом стакленом или пластичном суду који се користи у спектрофотометру)

Да би се резултат претворио у микрограме по милилитру, вредност у mg/mL треба помножити са 1.000. Укупна маса протеина у узорку добија се множењем концентрације запремином узорка у милилитрима.

Решени пример

Узорак даје очитавање апсорбанце од 0,5 на 280 nm. Није разблажен, па је фактор разблажења 1, а мерен је у стандардној кивети од 1 cm. Протеин је говеђи серумски албумин (BSA), који има коефицијент екстинкције од 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

У узорку од 1 mL, то износи приближно 0,75 mg укупног протеина, односно 750 μg/mL.

Коефицијенти екстинкције уобичајених протеина

Сваки протеин различито апсорбује светлост, јер сваки има различит број остатака триптофана и тирозина. Коефицијент екстинкције то описује за одређени протеин на 280 nm, у јединицама L/(g·cm). Уобичајено се користе следеће вредности:

Калкулатор може да прихвати и прилагођени коефицијент екстинкције за протеин који није на овој листи. За протеин са познатим аминокиселинским низом, ова вредност може се проценити формулом коју су Gill и von Hippel објавили 1989. године: ε₂₈₀ = (остаци триптофана × 5.500) + (остаци тирозина × 1.490) + (остаци цистина × 125). Та формула даје резултат у M⁻¹cm⁻¹, моларној јединици која се разликује од масених вредности L/(g·cm) наведених изнад. Бесплатни алати као што је ProtParam, који се налази на серверу ExPASy, израчунавају ову вредност директно из протеинског низа.

Дужина оптичког пута и фактор разблажења

Дужина оптичког пута је ширина кивете у којој се налази узорак, измерена у центиметрима. Стандардне кивете су широке 1 cm. Микрозапремински спектрофотометри, који мере веома мале узорке, могу користити знатно краћи оптички пут, на пример 0,1 cm.

Фактор разблажења узима у обзир свако разблаживање спроведено пре мерења. Ако би концентровани узорак дао апсорбанцу већу од 1,0, уобичајено је да се најпре разблажи пуфером. Фактор разблажења једнак је укупној запремини разблаженог узорка подељеној запремином оригиналног узорка. На пример, мешањем 10 μL узорка са 990 μL пуфера добија се укупна запремина од 1.000 μL и фактор разблажења од 100.

Други начини мерења концентрације протеина

Апсорбанца на 280 nm једна је од неколико уобичајених метода које се користе у лабораторији.

• Bradford тест: користи боју која мења боју када се веже за протеин. Добро функционише са непречишћеним узорцима, али промена боје може да варира између различитих протеина.
• BCA тест: ослања се на промену боје изазвану пептидним везама протеина. Компатибилан је са многим детерџентима, али његово извођење траје дуже него директно мерење апсорбанце.
• Lowry метода: старија метода која је веома осетљива, али слабо реагује са неким уобичајеним састојцима пуфера.

Свака од ове три методе уништава узорак. Директно мерење A280 не уништава узорак, па се исти узорак може сачувати и поново употребити.

Најчешће постављана питања

Који је идеалан опсег апсорбанце за ову методу?

Између 0,1 и 1,0. Испод 0,1 очитавање је непрецизно. Изнад 1,0 однос између апсорбанце и концентрације можда више није линеаран, па узорак најпре треба разблажити.

Зашто се мери на 280 nm, а не на 260 nm?

Нуклеинске киселине, као што су ДНК и РНК, снажно апсорбују на 260 nm. Протеини више апсорбују на 280 nm због садржаја триптофана и тирозина. Мерење на 280 nm смањује утицај нуклеинских киселина присутних у узорку.

Како се одређује коефицијент екстинкције за протеин који није на списку?

За протеин са познатим низом, алат као што је ProtParam израчунава га на основу броја остатака триптофана, тирозина и цистина. Може се измерити и директно, поређењем апсорбанце узорка са раствором познате концентрације.

Да ли ова метода функционише за смешу протеина?

Најбоље функционише за један пречишћен протеин са познатим коефицијентом екстинкције. Смеша непознатих протеина, као што је лизат ћелија, обично се уместо тога мери Bradford или BCA тестом, јер те методе дају доследнију процену укупне количине протеина.

Да ли детерџенти могу да утичу на очитавање?

Да. Многи детерџенти апсорбују светлост близу 280 nm, што може да изобличи резултат. Коришћење слепог узорка који садржи исту концентрацију детерџента помаже да се поништи та позадинска апсорбанца. Веома високе концентрације детерџента могу захтевати тест компатибилан са детерџентима, као што је BCA.