Калкулатор температуре везивања ДНК | Бесплатни PCR Tm алат

Шта је калкулатор температуре хибридизације ДНК?

Калкулатор температуре хибридизације ДНК процењује температуру топљења (Tm) ДНК прајмера на основу његове секвенце. Tm је температура при којој је половина молекула прајмера везана за циљни ланац, а друга половина није. У ланчаној реакцији полимеразе (PCR), ова вредност усмерава избор температуре за везивање прајмера за матрицу ДНК.

Зашто је температура хибридизације важна у PCR-у

PCR умножава циљни део ДНК кроз поновљене циклусе загревања и хлађења. Сваки циклус има три корака. Прво, загревање раздваја дволанчану матрицу на око 95 °C. Овај корак се назива денатурација. Друго, реакција се хлади до температуре хибридизације, обично између 50 °C и 65 °C, како би кратки прајмери могли да се вежу за комплементарне секвенце на једноланчаним ланцима. Треће, температура расте до око 72 °C, а ензим назван ДНК полимераза продужава прајмере и гради нове ланце ДНК.

Ако је температура хибридизације прениска, прајмери се везују за секвенце које се само делимично подударају, па настају додатни нежељени фрагменти ДНК. Ако је превисока, прајмери не могу да формирају стабилну везу са матрицом, па се копира мало или нимало ДНК. Температура хибридизације је једно од првих подешавања које истраживачи мењају када PCR реакција не успе.

Како садржај GC утиче на Tm

Прајмер се упарује са циљном секвенцом помоћу водоничних веза. Пар гуанин–цитозин (G-C) формира три водоничне везе. Пар аденин–тимин (A-T) формира две. Прајмер са више база G и C захтева више топлоте за раздвајање, па има виши Tm од прајмера исте дужине са више база A и T. Садржај GC се обично записује као проценат: број база G и C подељен укупном дужином секвенце, помножен са 100.

Формула за температуру хибридизације ДНК

Овај калкулатор примењује једну од две формуле, у зависности од дужине прајмера.

За прајмере од 14 нуклеотида или дуже, користи се Мармур–Дотијева формула за садржај GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Овде је N_GC број база G и C у прајмеру, избројан директно, а не изражен као проценат. N је укупан број база.

За прајмере краће од 14 нуклеотида користи се Воласово правило:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G и C представљају број појава сваке од тих база у прајмеру.

Обе формуле претпостављају уобичајене услове за PCR: око 50 наномола прајмера и 50 милимола Na+.

Решени пример

Узмимо прајмер од 19 база ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Његова дужина је 19, што је 14 или више, па калкулатор користи Мармур–Дотијеву формулу.

• Дужина (N) = 19
• Број G = 5, број C = 5, па је N_GC = 10, а садржај GC је 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Формула користи број база GC, 10, а не проценат GC, 52,6. Погрешна употреба процента даје Tm близу 143 °C, што није реалистична вредност за PCR реакцију која се одвија између 50 °C и 95 °C.

Како се користи овај калкулатор

Унесите или налепите секвенцу прајмера која садржи само слова A, T, G и C. Калкулатор приказује дужину секвенце у нуклеотидима (nt), садржај GC као проценат и израчунату температуру хибридизације у степенима Целзијуса. Резултат се може копирати у лабораторијске белешке или протокол.

Избор температуре хибридизације у PCR-у

Tm је израчуната процена, а не загарантована радна температура. Многи PCR протоколи почињу стварни корак хибридизације неколико степени испод израчунатог Tm-а, а затим се температура подешава на основу резултата на гелу. За пар прајмера обично се као почетна вредност користи нижа од две вредности Tm-а. Градијентни PCR, у коме се истовремено спроводи неколико реакција на различитим температурама, чест је начин да се испитивањем пронађе најбоља температура.

Други начини за процену Tm-а

Овде коришћене Мармур–Дотијева и Воласова формула представљају брзе апроксимације засноване само на саставу база. Постоје и друге методе:

• Термодинамика најближих суседа узима у обзир како сваки пар суседних база утиче на стабилност и сматра се прецизнијом методом за стандардне прајмере.
• Формуле кориговане за концентрацију соли додају корекцију за концентрацију јона Na+ или K+ у реакционом пуферу, јер већа концентрација соли стабилизује дволанчани дуплекс ДНК и повећава Tm.

Различити калкулатори могу да пријаве различите вредности Tm-а за исти прајмер јер користе различите формуле. Спровођење PCR-а и провера резултата остају коначни тест.

Најчешће постављана питања

Шта је температура хибридизације ДНК?

То је температура при којој се ДНК прајмери током PCR-а везују за одговарајућу секвенцу на матричном ланцу. У лабораторијама се она обично подешава неколико степени испод израчунате температуре топљења (Tm) прајмера.

Како се израчунава Tm прајмера?

За прајмере од 14 база или дуже, Tm = 64,9 + 41 × (број GC − 16,4) / дужина. За прајмере краће од 14 база, Tm = 2 × (број A+T) + 4 × (број G+C).

Зашто садржај GC повећава Tm?

Парови база G-C формирају три водоничне везе, у поређењу са две код парова A-T. Прајмер са већим уделом база G и C захтева више енергије, а тиме и вишу температуру, да би се одвојио од циљне секвенце.

Да ли температура хибридизације у PCR-у треба да буде једнака израчунатом Tm-у?

Не. Већина протокола почиње неколико степени испод израчунатог Tm-а и одатле подешава температуру, јер Tm означава тачку у којој је везана само половина прајмера.

Да ли дужина прајмера мења Tm?

Да, мада не на једноставан начин. Дужина се налази у имениоцу Мармур–Дотијеве формуле, па дужи прајмер са просечним садржајем GC нема аутоматски виши Tm од краћег прајмера богатог GC базама.

Зашто се различити калкулатори Tm-а не слажу?

Они користе различите формуле. Воласово правило, Мармур–Дотијева формула за садржај GC, термодинамика најближих суседа и формуле кориговане за концентрацију соли могу дати различите вредности Tm-а за исти прајмер, понекад са разликом од неколико степени.

Референце

1. Marmur J, Doty P. Одређивање састава база дезоксирибонуклеинске киселине на основу њене температуре термичке денатурације. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Хибридизација синтетичких олигодезоксирибонуклеотида са phi chi 174 ДНК. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Јединствени приказ термодинамике најближих суседа полимерне, ДНК у облику бучице и олигонуклеотидне ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.