Калкулатор ензимске активности - Михаелис-Ментенова кинетика

Калкулатор активности ензима

Калкулатор активности ензима одређује колико брзо ензим претвара супстрат у производ, што се изражава као специфична активност у јединицама по милиграму (U/mg). Он користи Михаелис-Ментенову једначину, стандардни модел ензимске кинетике, заједно са количином ензимског протеина у узорку.

Ензими су протеини који убрзавају хемијске реакције у ћелијама, а да се при том не троше. Научници мере активност ензима да би упоредили различите серије, проверили да ли је корак пречишћавања успео или испитали како лек утиче на брзину ензима. Сама вредност концентрације ензима не показује да ли ензим обавља своју функцију. То показује специфична активност.

Шта калкулатор израчунава

Алат користи пет улазних вредности: концентрацију ензима, концентрацију супстрата, Михаелисову константу (Km), максималну брзину (Vmax) и време реакције. Време реакције се бележи ради референце, али не улази у формулу. Vmax је већ брзина, односно количина супстрата претворена у јединици времена, па је време већ укључено у њу. Поновно дељење временом значило би да се оно рачуна два пута.

Калкулатор враћа један број и један графикон:

• Специфична активност, у До/мг. То је брзина реакције подељена количином присутног ензимског протеина.
• Графикон брзине реакције у односу на концентрацију супстрата, који приказује ниски, прелазни и засићени део криве. На њему је означена брзина при унетој концентрацији супстрата.

Како се израчунава активност ензима

Михаелис-Ментенова једначина

Леонор Михаелис и Мауд Ментен објавиле су овај модел 1913. Он описује како брзина реакције ензима зависи од концентрације супстрата:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = брзина реакције, односно брзина при датој концентрацији супстрата
• $V_{max}$ = максимална брзина, односно брзина када је ензим потпуно засићен супстратом
• $[S]$ = концентрација супстрата
• $K_m$ = Михаелисова константа: концентрација супстрата при којој је брзина једнака половини Vmax

Формула специфичне активности

Специфична активност се добија дељењем те брзине количином присутног ензимског протеина, а резултат се изражава у јединицама по милиграму (До/мг):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Овде је $A$ специфична активност, а $[E]$ концентрација ензима.

Једна јединица ензимске активности (U) је количина ензима која претвори 1 микромол (µmol) супстрата у минути. Ту дефиницију утврдила је Међународна унија за биохемију и молекуларну биологију (IUBMB).

Јединице се своде на следећи начин. У Михаелис-Ментеновој једначини, брзина има јединице концентрације супстрата подељене временом. Калкулатор узима [S] и Km у mM, па су Vmax и v изражени у µmol у минути по милилитру, односно µmol/(min·mL). То је исто што и mM/min, као и U/mL. Концентрација ензима [E] изражена је у mg/mL. Дељењем се милилитри скраћују:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax већ садржи „по минути“, па у формули нема посебног члана за време.

Овај прорачун претпоставља да је измерена брзина почетна брзина, добијена на почетку реакције, пре него што се супстрат знатно потроши или производ почне да инхибира ензим. Лабораторије обично мере првих 5–10% конверзије супстрата да би остале у том линеарном опсегу.

Решени пример

Пример 1. Концентрација ензима је 1 mg/mL, концентрација супстрата 10 mM, Km 5 mM, а Vmax 50 µmol/(min·mL). То су почетне вредности калкулатора.

Брзина = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Специфична активност = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Пример 2. Исти услови, али је концентрација ензима удвостручена на 2 mg/mL.

Брзина = 33,33 µmol/(min·mL), непромењена, јер брзина у овој једначини не зависи од [E]. Специфична активност = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Удвостручавање количине ензима преполовљује специфичну активност, јер се иста укупна брзина сада дели на двоструко већу количину протеина.

Пример 3. Супстрат је повећан на 100 mM, знатно изнад Km, уз концентрацију ензима 1 mg/mL, Km 5 mM и Vmax 50 µmol/(min·mL).

Брзина = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Специфична активност = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

При високој концентрацији супстрата ензим је готово засићен, па је брзина блиска вредности Vmax.

Пример 4. Супстрат је смањен на 1 mM, испод Km, уз концентрацију ензима 1 mg/mL, Km 5 mM и Vmax 50 µmol/(min·mL).

Брзина = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Специфична активност = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Испод Km, мала количина супстрата ограничава реакцију, па су и брзина и специфична активност знатно мање од Vmax.

Објашњење кључних параметара

Концентрација ензима [E] представља масу ензимског протеина по запремини, у mg/mL. Већа вредност распоређује исту брзину реакције на већу количину протеина, па смањује специфичну активност. Специфична активност, а не сама концентрација, показује да ли препарат ензима добро функционише.

Концентрација супстрата [S] представља количину супстрата која је ензиму доступна за реакцију, обично у mM. При ниској вредности [S], мала повећања нагло повећавају брзину. Близу засићења, додатни супстрат готово да не помаже.

Михаелисова константа (Km) је концентрација супстрата при којој је брзина једнака половини Vmax. Низак Km значи да ензим достиже половину максималне брзине при ниској концентрацији супстрата, што указује на чврсто везивање ензима и супстрата. На пример, хексокиназа има Km близу 0,1 mM за глукозу, што показује висок афинитет.

Максимална брзина (Vmax) је брзина када супстрат више није ограничавајући фактор. Унесите је у µmol/(min·mL), што је исто што и mM/min или U/mL, како би одговарала јединицама mM које се користе за [S] и Km. Она зависи од количине присутног ензима и брзине којом сваки молекул ензима може да претвара супстрат (његовог броја обрта, kcat).

Време реакције је време током којег је тест трајао. Помаже при планирању експеримента, јер реакција која предуго траје може исцрпсти супстрат и престати да се понаша линеарно. Оно није део саме формуле специфичне активности.

Тумачење криве брзине

Графикон приказује брзину у односу на концентрацију супстрата, користећи Михаелис-Ментенову једначину.

• Испод Km: брзина расте приближно сразмерно супстрату. Мале грешке у концентрацији супстрата изазивају велике грешке у резултату.
• Близу Km: крива се савија. Брзина је једнака половини Vmax.
• Изнад Km: крива се изравнава. Додатни супстрат мало повећава брзину, јер је ензим готово засићен.

Зашто је специфична активност важна

Специфична активност је стандардна мера чистоће и квалитета ензима. Током пречишћавања научници је прате у сваком кораку: сирови екстракт ћелија може показати неколико U/mg, док високо пречишћени узорак може достићи стотине или хиљаде U/mg. Повећање специфичне активности током процеса пречишћавања показује да се неактивни протеин уклања, док се испитивани ензим задржава.

Исто мерење подржава откривање лекова, где истраживачи испитују како једињења кандидати смањују активност ензима, као и клиничку дијагностику, где лекари мере ензиме као што су ALT и AST у крви да би проверили оштећење јетре.

Најчешће постављана питања

Како се израчунава активност ензима на основу Km и Vmax? Најпре пронађите брзину реакције Михаелис-Ментеновом једначином, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Затим је поделите концентрацијом ензима да бисте добили специфичну активност у U/mg: Активност = v / [E]. Нека Vmax буде у µmol/(min·mL), а [E] у mg/mL, како би се јединице скратиле на U/mg.

Шта је јединица (U) ензимске активности? Једна јединица је количина ензима која под наведеним условима претвара 1 µmol супстрата у минути, како је дефинисала IUBMB.

Зашто формула не укључује време реакције? Vmax је већ изражен као количина у јединици времена, па представља брзину, а не укупну количину. Поновно дељење временом двоструко би га урачунало и учинило да резултат зависи од трајања теста, што не би требало да се дешава код својства самог ензима.

Зашто специфична активност опада када концентрација ензима расте? Брзина у Михаелис-Ментеновој једначини не зависи од концентрације ензима. Специфична активност дели ту непромењену брзину са [E], па већа вредност [E] даје мањи резултат. Поређење специфичне активности, а не саме брзине, омогућава праведно поређење препарата ензима различитих концентрација.

Шта значи низак Km? Низак Km значи да ензим достиже половину максималне брзине при ниској концентрацији супстрата, што указује на чврсто везивање ензима и супстрата.

Може ли специфична активност бити негативна? Не. Негативан резултат указује на грешку у уносу, као што је негативна концентрација, или на грешку у прорачуну, а не на стварно мерење ензима.

Референце

1. Михаелис, Л. и Ментен, М. Л. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Берг, Ј. М., Тимочко, Ј. Л. и Страјер, Л. (2012). Биохемија (7. издање). W.H. Freeman and Company.
3. Међународна унија за биохемију и молекуларну биологију (IUBMB). Номенклатура ензима. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. База података ензима BRENDA. https://www.brenda-enzymes.org/