DNA Hybridiseringstemperatur Kalkylator | Gratis PCR Tm Verktyg

Vad är en kalkylator för DNA-annealingtemperatur?

En kalkylator för DNA-annealingtemperatur uppskattar smälttemperaturen (Tm) för en DNA-primer utifrån dess sekvens. Tm är den temperatur vid vilken hälften av primermolekylerna är bundna till sin målsträng och hälften inte är det. I en polymeraskedjereaktion (PCR) används detta värde som vägledning för den temperatur vid vilken primrarna binder till DNA-templaten.

Varför annealingtemperaturen är viktig i PCR

PCR kopierar en målsekvens av DNA genom upprepade uppvärmnings- och avkylningscykler. Varje cykel har tre steg. Först separeras den dubbelsträngade templaten genom uppvärmning till omkring 95 °C. Detta steg kallas denaturering. Sedan kyls reaktionen till annealingtemperaturen, vanligtvis mellan 50 °C och 65 °C, så att korta primrar kan binda till matchande sekvenser på enkelsträngarna. I det tredje steget stiger temperaturen till cirka 72 °C, och ett enzym som kallas DNA-polymeras förlänger primrarna och bygger nya DNA-strängar.

Om annealingtemperaturen är för låg binder primrarna till sekvenser som bara delvis matchar, vilket leder till extra oönskade DNA-fragment. Om den är för hög kan primrarna inte binda stabilt till templaten, och lite eller inget DNA kopieras. Annealingtemperaturen är en av de första inställningar som forskare justerar när en PCR-reaktion misslyckas.

Hur GC-halten påverkar Tm

En primer parar med sitt mål genom vätebindningar. Ett guanin-cytosinpar (G-C) bildar tre vätebindningar. Ett adenin-tyminpar (A-T) bildar två. En primer med fler G- och C-baser kräver mer värme för att separeras och har därför högre Tm än en lika lång primer med fler A- och T-baser. GC-halten anges vanligtvis som en procentsats: antalet G- och C-baser dividerat med den totala sekvenslängden, multiplicerat med 100.

Formel för DNA-annealingtemperatur

Den här kalkylatorn använder en av två formler, valda utifrån primerns längd.

För primrar på 14 nukleotider eller längre används Marmur-Dotys formel för GC-halt:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Här är N_GC antalet G- och C-baser i primern, räknat direkt och inte som en procentsats. N är det totala antalet baser.

För primrar som är kortare än 14 nukleotider används Wallace-regeln:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G och C anger vardera antalet av respektive bas i primern.

Båda formlerna förutsätter vanliga PCR-förhållanden: cirka 50 nanomolar primer och 50 millimolar Na+.

Räkneexempel

Betrakta primern med 19 baser ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Dess längd är 19, vilket är 14 eller mer, så kalkylatorn använder Marmur-Dotys formel.

• Längd (N) = 19
• Antal G = 5, antal C = 5, alltså är N_GC = 10, och GC-halten är 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formeln använder GC-antalet, 10, inte GC-procentsatsen, 52,6. Om procentsatsen används av misstag blir Tm nära 143 °C, vilket inte är ett realistiskt värde för en PCR-reaktion som körs mellan 50 °C och 95 °C.

Så använder du denna kalkylator

Skriv in eller klistra in en primersekvens som endast använder bokstäverna A, T, G och C. Kalkylatorn visar sekvenslängden i nukleotider (nt), GC-halten som en procentsats och den beräknade annealingtemperaturen i grader Celsius. Resultatet kan kopieras till laboratorieanteckningar eller ett protokoll.

Att välja annealingtemperatur för PCR

Tm är en beräknad uppskattning, inte en garanterad arbetstemperatur. Många PCR-protokoll börjar det faktiska annealingsteget några grader under den beräknade Tm och justerar sedan temperaturen utifrån resultatet på en gel. För ett primerpar används normalt det lägre av de två primerernas Tm-värden som utgångspunkt. Gradient-PCR, där flera reaktioner körs samtidigt över ett temperaturintervall, är ett vanligt sätt att hitta den bästa temperaturen genom att testa sig fram.

Andra sätt att uppskatta Tm

Marmur-Doty- och Wallace-formlerna som används här är snabba approximationer som enbart bygger på basernas sammansättning. Det finns andra metoder:

• Termodynamik enligt närmaste grannar tar hänsyn till hur varje intilliggande baspar påverkar stabiliteten och anses vara den mer noggranna metoden för standardprimrar.
• Saltjusterade formler lägger till en korrigering för koncentrationen av Na+- eller K+-joner i reaktionsbufferten, eftersom en högre saltkoncentration stabiliserar DNA-dubbelsträngen och höjer Tm.

Olika kalkylatorer kan rapportera olika Tm-värden för samma primer eftersom de använder olika formler. Att köra PCR-reaktionen och kontrollera resultatet är fortfarande det slutliga testet.

Vanliga frågor

Vad är DNA-annealingtemperatur?

Det är den temperatur vid vilken DNA-primrar binder till sin komplementära sekvens på templatsträngen under PCR. Laboratorier ställer vanligtvis in den några grader under primerns beräknade smälttemperatur (Tm).

Hur beräknas primerns Tm?

För primrar på 14 baser eller längre är Tm = 64,9 + 41 × (GC-antal − 16,4) / längd. För primrar som är kortare än 14 baser är Tm = 2 × (antal A+T) + 4 × (antal G+C).

Varför höjer GC-halten Tm?

G-C-baspar bildar tre vätebindningar, jämfört med två för A-T-par. En primer med en högre andel G- och C-baser kräver mer energi, och därmed högre temperatur, för att separeras från sitt mål.

Bör PCR-annealingtemperaturen vara lika med den beräknade Tm?

Nej. De flesta protokoll börjar flera grader under den beräknade Tm och justerar därifrån, eftersom Tm anger den punkt där endast hälften av primern är bunden.

Påverkar primerns längd Tm?

Ja, men inte på ett enkelt sätt. Längden står i nämnaren i Marmur-Dotys formel, så en längre primer med genomsnittlig GC-halt har inte automatiskt högre Tm än en kortare primer som är rik på GC.

Varför ger olika Tm-kalkylatorer olika resultat?

De använder olika formler. Wallace-regeln, Marmur-Dotys formel för GC-halt, termodynamik enligt närmaste granne och saltjusterade formler kan ge olika Tm för samma primer, ibland med flera graders skillnad.

Referenser

1. Marmur J, Doty P. Bestämning av bas­sammansättningen hos deoxiribonukleinsyra utifrån dess termiska denatureringstemperatur. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridisering av syntetiska oligodeoxiribonukleotider med phi chi 174-DNA. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. En enhetlig bild av termodynamiken hos polymer-, hantel- och oligonukleotid-DNA enligt närmaste-grannmodellen. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.