DNA Ligation Calculator

Introduktion

DNA-ligation är en kritisk teknik inom molekylärbiologi som används för att sammanfoga DNA-fragment med kovalenta bindningar. DNA Ligation Calculator är ett viktigt verktyg för forskare, som hjälper till att bestämma de optimala mängderna av vektor- och insert-DNA som behövs för lyckade ligationsreaktioner. Genom att beräkna de korrekta molära förhållandena mellan vektor (plasmid) och insert-DNA-fragment säkerställer denna kalkylator effektiva molekylärkloningsexperiment samtidigt som den minimerar slöseri med reagenser och misslyckade reaktioner.

Ligationreaktioner är grundläggande för genetisk ingenjörskonst, syntetisk biologi och molekylärkloning. De gör det möjligt för forskare att skapa rekombinanta DNA-molekyler genom att infoga gener av intresse i plasmidvektorer för efterföljande transformation till värdorganismer. Framgången för dessa reaktioner beror starkt på att de lämpliga mängderna av DNA-komponenter används, vilket är precis vad denna kalkylator hjälper till att bestämma.

Oavsett om du konstruerar uttrycksvektorer, skapar genbibliotek eller utför rutinmässig subkloning, kommer denna DNA-ligationkalkylator att hjälpa dig att optimera dina experimentella förhållanden och öka din framgångsgrad. Genom att ange några nyckelparametrar om dina DNA-prover kan du snabbt få fram de exakta volymer som behövs för din specifika ligationsreaktion.

Formel/Beräkning

DNA-ligationkalkylatorn använder en grundläggande molekylärbiologisk formel som tar hänsyn till de olika storlekarna och koncentrationerna av de DNA-fragment som ska sammanfogas. Den primära beräkningen bestämmer hur mycket insert-DNA som behövs i förhållande till vektor-DNA baserat på deras respektive längder och det önskade molära förhållandet.

Beräkning av insertmängd

Mängden insert-DNA som behövs (i nanogram) beräknas med följande formel:

$\text{ng av insert} = \text{ng av vektor} \times \frac{\text{kb storlek av insert}}{\text{kb storlek av vektor}} \times \text{molärt förhållande}$

Där:

• ng av vektor = mängd vektor-DNA som används i reaktionen (vanligtvis 50-100 ng)
• kb storlek av insert = längd av insert-DNA-fragmentet i kilobaspar (kb)
• kb storlek av vektor = längd av vektor-DNA i kilobaspar (kb)
• molärt förhållande = önskat förhållande av insertmolekyler till vektormolekyler (vanligtvis 3:1 till 5:1)

Volymberäkningar

När den erforderliga mängden insert-DNA har bestämts beräknas de volymer som behövs för reaktionen:

$\text{Vektorvolym (μL)} = \frac{\text{ng av vektor}}{\text{vektor koncentration (ng/μL)}}$

$\text{Insertvolym (μL)} = \frac{\text{ng av insert}}{\text{insert koncentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffert/vattenvolym (μL)} = \text{Total reaktionsvolym (μL)} - \text{Vektorvolym (μL)} - \text{Insertvolym (μL)}$

Exempelberäkning

Låt oss gå igenom ett praktiskt exempel:

• Vektor koncentration: 50 ng/μL
• Vektor längd: 3000 bp (3 kb)
• Insert koncentration: 25 ng/μL
• Insert längd: 1000 bp (1 kb)
• Önskat molärt förhållande (insert:vektor): 3:1
• Total reaktionsvolym: 20 μL
• Vektormängd att använda: 50 ng

Steg 1: Beräkna den erforderliga insertmängden $\text{ng av insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Steg 2: Beräkna volymerna $\text{Vektorvolym} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insertvolym} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffert/vattenvolym} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Denna beräkning säkerställer att det finns tre insertmolekyler för varje vektormolekyl i reaktionen, vilket optimerar chanserna för lyckad ligation.

Steg-för-steg-guide för att använda kalkylatorn

Vår DNA-ligationkalkylator är utformad för att vara intuitiv och enkel. Följ dessa steg för att beräkna de optimala volymerna för din ligationsreaktion:

1. Ange vektorinformation:

   • Ange din vektorkoncentration i ng/μL
   • Ange vektor längd i baspar (bp)
   • Specificera mängden vektor-DNA du vill använda i reaktionen (ng)

2. Ange insertinformation:

   • Ange din insertkoncentration i ng/μL
   • Ange insert längd i baspar (bp)

3. Ställ in reaktionsparametrar:

   • Specificera det önskade molära förhållandet (insert:vektor) - vanligtvis mellan 3:1 och 5:1
   • Ange den totala reaktionsvolymen i μL (vanligtvis 10-20 μL)

4. Visa resultat:

   • Kalkylatorn kommer automatiskt att visa:
     • Vektorvolym som krävs (μL)
     • Insertvolym som krävs (μL)
     • Buffert/vattenvolym att tillsätta (μL)
     • Total reaktionsvolym (μL)
     • Mängd vektor och insert-DNA i reaktionen (ng)

5. Kopiera resultat (valfritt):

   • Använd knappen "Kopiera resultat" för att kopiera alla beräkningar till ditt urklipp för din labbnotering eller protokoll

Kalkylatorn utför valideringskontroller för att säkerställa att alla inmatningar är positiva tal och att den totala volymen är tillräcklig för de erforderliga DNA-volymerna. Om några fel upptäcks kommer hjälpsamma felmeddelanden att vägleda dig för att korrigera inmatningarna.

Användningsområden

DNA-ligationkalkylatorn är värdefull inom många molekylärbiologiska tillämpningar:

Molekylär kloning

Det vanligaste användningsområdet är standard molekylär kloning, där forskare infogar gener eller DNA-fragment i plasmidvektorer. Kalkylatorn säkerställer optimala förhållanden för:

• Subkloning av gener mellan olika uttrycksvektorer
• Skapande av fusionsproteiner genom att sammanfoga flera genfragment
• Konstruktion av reporter genassayer
• Byggande av plasmidbibliotek

Syntetisk biologi

Inom syntetisk biologi, där flera DNA-fragment ofta sätts ihop:

• Gibson Assembly-reaktioner drar nytta av precisa insert:vektor-förhållanden
• Golden Gate-assemblagesystem kräver specifika DNA-koncentrationer
• BioBrick-assemblage av standardiserade genetiska delar
• Konstruktion av syntetiska genetiska kretsar

Utveckling av diagnostiska kit

Vid utveckling av molekylära diagnostiska verktyg:

• Kloning av sjukdomsspecifika genetiska markörer
• Konstruktion av positiva kontrollplasmider
• Utveckling av kalibreringsstandarder för qPCR

Proteinuttryckssystem

För forskare som arbetar med proteinproduktion:

• Optimera insert:vektor-förhållanden för högkopiuttrycksvektorer
• Konstruera inducerbara uttryktsystem
• Skapa sekretionsvektorer för proteinrening

CRISPR-Cas9-tillämpningar

I genredigeringstillämpningar:

• Kloning av guide-RNA i CRISPR-vektorer
• Skapa donortemplat för homolog reparation
• Bygga bibliotek av guide-RNA för screening

Utmanande ligationer

Kalkylatorn är särskilt värdefull för utmanande ligationsscenarier:

• Kloning av stora inserts (>5 kb)
• Mycket små fragmentinfogningar (<100 bp)
• Blunt-end ligationer som har lägre effektivitet
• Multi-fragment sammansättningsreaktioner

Alternativ

Även om vår DNA-ligationkalkylator ger precisa beräkningar för traditionella ligationsreaktioner, finns det flera alternativa metoder för att sammanfoga DNA-fragment:

1. Gibson Assembly: Använder exonukleas, polymeras och ligas i en enda reaktionsrör för att sammanfoga överlappande DNA-fragment. Inga traditionella ligationsberäkningar behövs, men koncentrationsförhållanden är fortfarande viktiga.

2. Golden Gate Assembly: Använder typ IIS-restriktionsenzymer för riktad, scarless sammansättning av flera fragment. Kräver ekvivalenta mängder av alla fragment.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Använder exonukleas för att skapa enkelsträngade överhäng som binder ihop. Använder vanligtvis ekvivalenta förhållanden av fragment.

4. In-Fusion Cloning: Kommersiellt system som tillåter sammanfogning av fragment med 15 bp överlappningar. Använder ett specifikt förhållande baserat på fragmentstorlekar.

5. Gateway Cloning: Använder plats-specifik rekombination istället för ligation. Kräver specifika inträdes- och destinationsvektorer.

6. Empirisk testning: Vissa laboratorier föredrar att ställa in flera ligationsreaktioner med olika insert:vektor-förhållanden (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) och avgöra vilken som fungerar bäst för deras specifika konstruktioner.

7. Programvarukalkylatorer: Kommersiella programvarupaket som Vector NTI och SnapGene inkluderar ligationskalkylatorer med ytterligare funktioner som restriktionsstedsanalys.

Historia

Utvecklingen av DNA-ligationberäkningar parallellerar evolutionen av molekylär kloningstekniker, som har revolutionerat molekylärbiologi och bioteknik.

Tidiga utvecklingar (1970-talet)

Konceptet för DNA-ligation för molekylär kloning uppstod i början av 1970-talet med de banbrytande arbetena av Paul Berg, Herbert Boyer och Stanley Cohen, som utvecklade de första rekombinanta DNA-molekylerna. Under denna period var ligationsreaktioner i stor utsträckning empiriska, med forskare som använde försök och misstag för att bestämma optimala förhållanden.

Upptäckten av restriktionsenzymer och DNA-ligas gav de nödvändiga verktygen för att klippa och återförenas DNA-molekyler. T4 DNA-ligas, isolerat från T4-bakteriofag-infekterade E. coli, blev det standardiserade enzymet för att sammanfoga DNA-fragment på grund av dess förmåga att ligatera både blunt och koherenta ändar.

Förbättringsperiod (1980-1990)

När molekylär kloning blev mer rutinmässig började forskare utveckla mer systematiska tillvägagångssätt för ligationsreaktioner. Vikten av molära förhållanden mellan vektor- och insert-DNA blev uppenbar, vilket ledde till utvecklingen av den grundläggande formeln som fortfarande används idag.

Under denna period fastställde forskare att överskott av insert-DNA (vanligtvis 3:1 till 5:1 molärt förhållande av insert till vektor) generellt förbättrade ligationseffektiviteten för standard kloningstillämpningar. Denna kunskap delades först genom laboratorieprotokoll och nådde gradvis in i molekylärbiologiska manualer och läroböcker.

Modern tid (2000-talet-nutid)

Framväxten av datorverktyg och online-kalkylatorer under 2000-talet gjorde precisa ligationsberäkningar mer tillgängliga för forskare. När molekylärbiologiska tekniker blev mer sofistikerade blev behovet av noggranna beräkningar mer kritiskt, särskilt för utmanande kloningsprojekt som involverade flera fragment eller stora inserts.

Idag är DNA-ligationberäkningar en integrerad del av molekylär kloningsarbetsflöden, med dedikerade kalkylatorer som denna som hjälper forskare att optimera sina experiment. Den grundläggande formeln har förblivit i stort sett oförändrad, även om vår förståelse av de faktorer som påverkar ligationseffektiviteten har förbättrats.

Framväxten av alternativa kloningmetoder som Gibson Assembly och Golden Gate-kloning har introducerat nya beräkningsbehov, men det grundläggande konceptet med molära förhållanden mellan DNA-fragment förblir viktigt över dessa tekniker.

Kodexempel

Här är implementationer av DNA-ligationkalkylatorn i olika programmeringsspråk:

1' Excel VBA-funktion för DNA-ligationkalkylator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Beräkna erforderlig insertmängd i ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Beräkna vektorvolym i μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Beräkna insertvolym i μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Beräkna buffert/vattenvolym i μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Användningsexempel i en cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Beräkna volymer för en DNA-ligationreaktion.
5    
6    Parametrar:
7    vector_concentration (float): Koncentration av vektor-DNA i ng/μL
8    vector_length (float): Längd av vektor-DNA i baspar
9    insert_concentration (float): Koncentration av insert-DNA i ng/μL
10    insert_length (float): Längd av insert-DNA i baspar
11    molar_ratio (float): Önskat molärt förhållande av insert:vektor
12    total_volume (float): Total reaktionsvolym i μL
13    vector_amount (float): Mängd vektor-DNA att använda i ng (standard: 50)
14    
15    Returnerar:
16    dict: Ordbok som innehåller beräknade volymer och mängder
17    """
18    # Beräkna vektorvolym
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Beräkna erforderlig insertmängd
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Beräkna insertvolym
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Beräkna buffert/vattenvolym
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Exempel på användning
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffert: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Konvertera längder till kb för beräkning
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Beräkna erforderlig insertmängd
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Beräkna volymer
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Exempel på användning
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffert: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Konvertera längder till kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Beräkna erforderlig insertmängd
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Beräkna volymer
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Runda till 2 decimaler
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffert: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Konvertera längder till kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Beräkna erforderlig insertmängd
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Beräkna volymer
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Runda till 2 decimaler
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffert: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Vanliga frågor (FAQ)

Vad är det optimala molära förhållandet för DNA-ligation?

Det optimala molära förhållandet av insert till vektor ligger vanligtvis mellan 3:1 och 5:1 för standard ligationsapplikationer. Detta kan dock variera beroende på det specifika ligationsscenariot:

• För blunt-end ligationer: 3:1 till 5:1
• För sticky-end ligationer: 1:1 till 3:1
• För stora inserts (>10 kb): 1:1 till 2:1
• För små inserts (<500 bp): 5:1 till 10:1
• För multi-fragment sammansättning: 3:1 för varje insert till vektor

Varför misslyckas min ligationsreaktion trots att jag använder de beräknade volymerna?

Flera faktorer kan påverka ligationseffektiviteten utöver det molära förhållandet:

1. DNA-kvalitet: Se till att både vektor och insert har rena ändar utan skador
2. Dephosphorylering: Kontrollera om din vektor har dephosphorylerats, vilket förhindrar självliga
3. Enzymaktivitet: Verifiera att ditt ligas är aktivt och används vid rätt temperatur
4. Inkubationstid: Vissa ligationer gynnas av längre inkubation (övernattning vid 16°C)
5. Buffertförhållanden: Se till att rätt buffert med ATP används
6. Kontaminanter: Rena DNA för att ta bort hämmande ämnen som EDTA eller hög salthalt

Hur mycket vektor-DNA bör jag använda i en ligationsreaktion?

Vanligtvis rekommenderas 50-100 ng av vektor-DNA för standard ligationsreaktioner. Att använda för mycket vektor kan leda till högre bakgrund av okapade eller självliga vektorer, medan för lite kan minska transformations effektiviteten. För utmanande ligationer kan du behöva optimera denna mängd.

Ska jag justera beräkningarna för blunt-end jämfört med sticky-end ligationer?

Ja. Blunt-end ligationer är generellt mindre effektiva än sticky-end (koherenta ändar) ligationer. För blunt-end ligationer, använd:

• Högre molära förhållanden (3:1 till 5:1 eller ännu högre)
• Mer T4 DNA-ligas (vanligtvis 2-3 gånger mer)
• Längre inkubationstider
• Överväg att tillsätta PEG för att förbättra ligationseffektiviteten

Hur beräknar jag ligation för flera inserts?

För sammansättning av flera fragment:

1. Beräkna varje insertmängd individuellt med samma formel
2. Upprätthåll samma totala molära förhållande (t.ex. för två inserts, använd 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vektor)
3. Justera den totala reaktionsvolymen för att rymma alla DNA-fragment
4. Överväg sekventiell ligation eller användning av sammansättningsmetoder som Gibson Assembly för flera fragment

Kan jag använda denna kalkylator för Gibson Assembly eller Golden Gate Assembly?

Denna kalkylator är specifikt utformad för traditionella restriktionsenzym- och ligasbaserade kloning. För Gibson Assembly rekommenderas vanligtvis ekvivalenta mängder av alla fragment (1:1-förhållande), även om den grundläggande beräkningen av DNA-mängd baserat på längd är liknande. För Golden Gate Assembly används också ekvivalenta förhållanden av alla komponenter.

Hur tar jag hänsyn till vektordephosphorylering i mina beräkningar?

Dephosphorylering av vektorn (borttagning av 5'-fosfatgrupper) förhindrar självliga men ändrar inte mängdberäkningarna. För dephosphorylerade vektorer:

1. Använd färskt insert-DNA med intakta 5'-fosfater
2. Överväg att använda något högre insert:vektor-förhållanden (4:1 till 6:1)
3. Se till längre ligationstider (minst 1 timme vid rumstemperatur eller övernattning vid 16°C)

Vad är den minimi totala reaktionsvolymen jag bör använda?

Den minimi praktiska reaktionsvolymen är vanligtvis 10 μL, vilket möjliggör adekvat blandning och förhindrar avdunstningsproblem. Om dina beräknade DNA-volymer överstiger den önskade reaktionsvolymen har du flera alternativ:

1. Använd mer koncentrerade DNA-prover
2. Minska mängden vektor som används (t.ex. 25 ng istället för 50 ng)
3. Öka den totala reaktionsvolymen
4. Överväg att koncentrera dina DNA-prover

Hur länge ska jag inkubera min ligationsreaktion?

Optimala inkubationstider varierar beroende på ligationstyp:

• Sticky-end ligationer: 1 timme vid rumstemperatur (22-25°C) eller 4-16 timmar vid 16°C
• Blunt-end ligationer: 2-4 timmar vid rumstemperatur eller övernattning (12-16 timmar) vid 16°C
• Snabba ligationer (använder högkoncentrerat ligas): 5-15 minuter vid rumstemperatur

Kan jag återanvända överbliven ligationsreaktion för transformation?

Ja, ligationsblandningar kan vanligtvis lagras vid -20°C och återanvändas för transformation. Varje frysnings-tiningscykel kan dock minska effektiviteten. För bästa resultat:

1. Aliquot ligationsblandningen innan frysning
2. Värmeinaktivera ligaset (65°C i 10 minuter) innan lagring
3. Använd inom 1-2 månader för optimala resultat

Referenser

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/