DNA-ligationsberäknare - Beräkna Insert:Vektor-proportioner för molekylär kloning

DNA-ligering är steget i molekylär kloning där ett insertfragment ligeras in i en plasmidvektor med hjälp av enzymet T4-DNA-ligas. En kalkylator för DNA-ligering räknar ut hur många mikroliter insert-DNA och vektor-DNA som ska blandas för att reaktionen ska nå ett valt molärt förhållande mellan insert och vektor.

Vad kalkylatorn gör

Kalkylatorn använder sex indata: vektorkoncentration, vektorlängd, insertkoncentration, insertlängd, önskat molärt förhållande mellan insert och vektor samt reaktionens totala volym. Det går också att ange hur mycket vektor-DNA som ska användas; standardvärdet är 50 nanogram (ng). Utifrån dessa värden beräknar den den volym vektor som ska pipetteras, den volym insert som ska pipetteras samt hur mycket buffert eller vatten som ska tillsättas för att nå den totala reaktionsvolymen.

Koncentrationen mäts i nanogram per mikroliter (ng/μL) och avläses vanligtvis med ett Nanodrop- eller Qubit-instrument. Längden mäts i baspar (bp). En kilobas (kb) motsvarar 1000 baspar. Det molära förhållandet anger hur många insertmolekyler som ska finnas för varje vektormolekyl. Det är inte ett massförhållande.

Varför molärt förhållande används i stället för massa

Lika massor av DNA innehåller inte lika många molekyler. Ett kort insert väger mindre än en lång vektor med samma antal molekyler. Om lika många nanogram av ett kort insert och en lång vektor blandas, skulle det finnas alldeles för få insertmolekyler i förhållande till antalet vektormolekyler. Kalkylatorn skalar insertmassan efter förhållandet mellan fragmentens längder, så att den slutliga blandningen innehåller det avsedda antalet insertmolekyler per vektormolekyl.

Formel för DNA-ligering

Den mängd insert-DNA som behövs, i nanogram, är:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

där $m_i$ är mängden insert i nanogram, $m_v$ mängden vektor i nanogram, $k_i$ insertlängden i kilobaser, $k_v$ vektorlängden i kilobaser och R det önskade molära förhållandet mellan insert och vektor.

När denna mängd är känd omvandlar kalkylatorn varje mängd till en volym som kan pipetteras:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

där $V_v$ och $V_i$ är vektor- respektive insertvolymen i mikroliter, $c_v$ och $c_i$ är vektor- respektive insertkoncentrationen i nanogram per mikroliter, $V_b$ är buffertvolymen och $V_t$ den totala reaktionsvolymen.

Om vektorvolymen och insertvolymen tillsammans är större än den totala reaktionsvolymen finns inget utrymme kvar att tillsätta buffert, ligas eller vatten. I så fall anger kalkylatorn att den totala volymen är för liten i stället för att visa en negativ buffertmängd.

Räkneexempel

En forskare klonar ett 1 kb stort genfragment in i en 3 kb stor plasmidvektor. Planen är att använda 50 ng vektor-DNA vid ett 3:1 molärt förhållande mellan insert och vektor, i en reaktion på 20 μL.

Indata:

• Vektorkoncentration: 50 ng/μL
• Vektorlängd: 3000 bp (3 kb)
• Insertkoncentration: 25 ng/μL
• Insertlängd: 1000 bp (1 kb)
• Molärt förhållande: 3
• Total volym: 20 μL
• Vektormängd: 50 ng

Steg 1: mängd insert

ng insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Steg 2: volymer

Vektorvolym = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertvolym = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Buffertvolym = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaktionen består av 1 μL vektor, 2 μL insert och 17 μL buffert eller vatten, vilket också är den volym där ligaset och dess reaktionsbuffert tillsätts. Blandningen ger tre insertmolekyler för varje vektormolekyl.

Typiska molära förhållanden vid ligering

Vid de flesta standardkloningar med klibbiga, utskjutande ändar används ett förhållande på 3:1 mellan insert och vektor. Ligeringar där trubbiga ändar fogas samman är mindre effektiva, så ett högre förhållande, till exempel 5:1, är vanligt. Mycket stora insertfragment fungerar ibland bättre med ett lägre förhållande, närmare 1:1, eftersom stora fragment redan bidrar med många baspar per molekyl.

Vanliga frågor

Vad är DNA-ligering?

DNA-ligering innebär att två DNA-fragment, vanligtvis en plasmidvektor och ett insert, fogas samman till en enda sammanhängande molekyl. Enzymet T4-DNA-ligas förseglar förbindelsen mellan fragmentens ändar.

Vad betyder det molära förhållandet mellan insert och vektor?

Det är antalet insert-DNA-molekyler som finns för varje vektormolekyl i reaktionen. Ett förhållande på 3:1 innebär tre insertmolekyler för varje vektormolekyl, oavsett hur deras massor förhåller sig till varandra.

Varför används inte lika många nanogram vektor och insert?

DNA-fragment med olika längd har olika massa per molekyl. Ett 1 kb stort insert väger ungefär en tredjedel så mycket som en 3 kb stor vektor, molekyl för molekyl. Lika många nanogram av vardera skulle inte ge lika många molekyler, så kalkylatorn justerar insertmassan för att motsvara det önskade molära förhållandet.

Vad innebär det att den totala volymen är för liten?

Det innebär att vektor- och insertvolymerna ensamma redan fyller hela reaktionsvolymen, så att inget utrymme återstår för buffert eller ligas. Lösningen är att öka den totala reaktionsvolymen eller använda mer koncentrerade DNA-stamlösningar.

Kan denna kalkylator användas för Gibson Assembly eller Golden Gate-kloning?

Nej. Dessa metoder använder en annan reaktionskemi och är vanligtvis inriktade på ekvimolära mängder av alla fragment i stället för ett fast förhållande mellan insert och vektor. Volymberäkningarna skiljer sig från standardkloning med T4-ligas.

Hur mycket vektor-DNA används vanligtvis?

50 ng är en vanlig utgångsmängd för en standardreaktion för ligering. Laboratorier använder också mängder från 25 till 100 ng, anpassade efter DNA-koncentrationen och reaktionens skala.