Beräkna DNA-koncentration från absorbansavläsningar (A260) med justerbara utspädningsfaktorer. Viktigt verktyg för molekylärbiologiska laboratorier och genetisk forskning.
DNA-koncentrationen beräknas med följande formel:
En DNA-koncentrationsberäknare är ett viktigt onlineverktyg som hjälper molekylärbiologer, genetikare och laboratorietekniker att noggrant bestämma DNA-koncentration från spektrofotometriska mätningar. Denna kostnadsfria beräknare använder den standardiserade A260-metoden för att konvertera UV-absorptionsmätningar till exakta DNA-koncentrationsvärden i ng/μL.
Mätning av DNA-koncentration är en grundläggande procedur i molekylärbiologiska laboratorier och fungerar som ett kritiskt kvalitetskontrollsteg före PCR, sekvensering, kloning och andra molekylära tekniker. Vår beräknare eliminerar manuella beräkningar och minskar fel vid bestämning av både koncentration och totala DNA-mängder i dina prover.
Beräkning av DNA-koncentration bygger på Beer-Lambert-lagen, som säger att absorbansen av en lösning är direkt proportionell mot koncentrationen av de absorberande arterna i lösningen och ljusets väg längs lösningen. För dubbelsträngat DNA motsvarar en absorbans av 1.0 vid 260 nm (A260) i en 1 cm väg längs en cuvette en koncentration av cirka 50 ng/μL.
DNA-koncentrationen beräknas med följande formel:
Där:
Den totala mängden DNA i provet kan sedan beräknas med:
Absorbans vid 260 nm (A260):
Konverteringsfaktor (50):
Utspädningsfaktor:
Volym:
Följ denna enkla process för att beräkna DNA-koncentration från dina A260-mätningar:
Mätning av DNA-koncentration är avgörande för många molekylärbiologiska och forskningsapplikationer:
Innan DNA-fragment ligieras in i vektorer, gör kunskap om den exakta koncentrationen att forskare kan beräkna det optimala förhållandet mellan insats och vektor, vilket maximerar transformations effektiviteten. Till exempel ger ett 3:1 molärt förhållande mellan insats och vektor ofta de bästa resultaten, vilket kräver precisa koncentrationsmätningar av båda komponenterna.
PCR-reaktioner kräver vanligtvis 1-10 ng av mall-DNA för optimal amplifikation. För lite DNA kan leda till misslyckande av amplifikation, medan för mycket kan hämma reaktionen. För kvantitativ PCR (qPCR) är ännu mer exakt DNA- kvantifiering nödvändig för att säkerställa noggranna standardkurvor och tillförlitlig kvantifiering.
NGS-biblioteksberedningsprotokoll specificerar exakta DNA-ingångsmängder, ofta i intervallet 1-500 ng beroende på plattform och tillämpning. Noggrann koncentrationsmätning är avgörande för framgångsrik biblioteksberedning och balanserad representation av prover i multiplexade sekvenseringskörningar.
När DNA introduceras i eukaryota celler varierar den optimala DNA-mängden beroende på celltyp och transfektionsmetod. Vanligtvis används 0.5-5 μg plasmid-DNA per brunn i ett 6-brunnarsformat, vilket kräver noggrann koncentrationsmätning för att standardisera experiment.
I rättsmedicinska tillämpningar är DNA-prover ofta begränsade och värdefulla. Noggrann kvantifiering gör att rättsmedicinska forskare kan avgöra om tillräckligt med DNA finns för profilering och för att standardisera mängden DNA som används i efterföljande analyser.
Restriktionsenzymer har specifika aktivitetsenheter definierade per μg DNA. Att känna till den exakta DNA-koncentrationen möjliggör korrekta enzym-till-DNA-förhållanden, vilket säkerställer fullständig nedbrytning utan stjärnaktivitet (icke-specifik klippning).
Även om UV-spektrofotometri är den vanligaste metoden för DNA-kvantifiering, finns det flera alternativ:
Fluorometriska metoder:
Agarosgel-elektrofores:
Real-Time PCR:
Digital PCR:
Förmågan att noggrant mäta DNA-koncentration har utvecklats avsevärt i takt med framsteg inom molekylärbiologi:
Efter upptäckten av DNA:s struktur av Watson och Crick 1953 började forskare utveckla metoder för att isolera och kvantifiera DNA. Tidiga metoder förlitade sig på kolorimetriska tester som diphenylamine-reaktionen, som producerade en blå färg när den reagerade med deoxiribossockret i DNA. Dessa metoder var relativt okänsliga och benägna att störningar.
Tillämpningen av UV-spektrofotometri för kvantifiering av nukleinsyror blev utbredd under 1970-talet. Forskare upptäckte att DNA absorberade UV-ljus med ett maximum vid 260 nm, och att förhållandet mellan absorbans och koncentration var linjärt inom ett visst intervall. Konverteringsfaktorn på 50 ng/μL för dubbelsträngat DNA vid A260 = 1.0 fastställdes under denna period.
Utvecklingen av DNA-specifika fluorescerande färger under 1980-talet och 1990-talet revolutionerade DNA-kvantifiering, särskilt för utspädda prover. Hoechst-färger och senare PicoGreen möjliggjorde mycket mer känslig detektion än vad som var möjligt med spektrofotometri. Dessa metoder blev särskilt viktiga med framväxten av PCR, som ofta krävde exakt kvantifiering av små mängder DNA.
Introduktionen av mikrovolym-spektrofotometrar som NanoDrop i början av 2000-talet transformerade rutinmässig DNA-kvantifiering genom att kräva endast 0.5-2 μL av provet. Denna teknik eliminerade behovet av utspädningar och cuvetter, vilket gjorde processen snabbare och mer bekväm.
Idag har avancerade tekniker som digital PCR och next-generation sequencing pressat gränserna för DNA-kvantifiering ännu längre, vilket möjliggör absolut kvantifiering av specifika sekvenser och detektion av enskilda molekyler. Men den grundläggande spektrofotometriska principen som fastställdes för decennier sedan förblir ryggraden i rutinmässig DNA-koncentrationsmätning i laboratorier världen över.
Låt oss gå igenom några praktiska exempel på DNA-koncentrationsberäkningar:
En forskare har renat en plasmid och fått följande mätningar:
Beräkning:
Efter att ha extraherat genomiskt DNA från blod:
Beräkning:
Ett sekvenseringsprotokoll kräver exakt 500 ng DNA:
Volym som behövs = 500 ÷ 125 = 4 μL av DNA-lösning
Här är exempel på hur man beräknar DNA-koncentration i olika programmeringsspråk:
1' Excel-formel för DNA-koncentration
2=A260*50*Utspädningsfaktor
3
4' Excel-formel för total DNA-mängd i μg
5=(A260*50*Utspädningsfaktor*Volym)/1000
6
7' Exempel i en cell med A260=0.5, Utspädningsfaktor=2, Volym=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Resultat: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Beräkna DNA-koncentration i ng/μL
4
5 Parametrar:
6 absorbance (float): Absorbansmätning vid 260 nm
7 dilution_factor (float): Utspädningsfaktor för provet
8
9 Returnerar:
10 float: DNA-koncentration i ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15 """
16 Beräkna total DNA-mängd i μg
17
18 Parametrar:
19 concentration (float): DNA-koncentration i ng/μL
20 volume_ul (float): Volym av DNA-lösning i μL
21
22 Returnerar:
23 float: Total DNA-mängd i μg
24 """
25 return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Exempelanvändning
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNA-koncentration: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Total DNA: {total_dna:.2f} μg")
371function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2 // Returnerar DNA-koncentration i ng/μL
3 return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7 // Returnerar total DNA-mängd i μg
8 return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Exempelanvändning
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA-koncentration: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Total DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21public class DNACalculator { /** * Beräkna DNA-koncentration i ng/μL * * @param absorbance Absorbansmätning vid 260 nm * @param dilutionFactor Utspädningsfaktor för provet * @return DNA-koncentration i ng/μL */ public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) { return absorbance * 50 * dilutionFactor
Upptäck fler verktyg som kan vara användbara för din arbetsflöde