DNA Koncentrationsberäknare | A260 till ng/μL Konverterare

Kalkylator för DNA-koncentration

En kalkylator för DNA-koncentration omvandlar ett UV-absorbanstal vid 260 nanometer, kallat A260, till DNA-koncentration i nanogram per mikroliter (ng/µL). Den anger också den totala mängden DNA i ett prov, i mikrogram (µg).

Vad är absorbans vid A260?

A260 är mängden ultraviolett ljus som en lösning absorberar vid en våglängd på 260 nanometer. DNA absorberar UV-ljus starkast nära denna våglängd på grund av sina nukleotidbaser. En spektrofotometer mäter A260 efter en blankmätning, där samma buffert som i provet används för att ta bort bakgrundsabsorbans. Ju mer DNA lösningen innehåller, desto högre blir A260-värdet.

Formel för DNA-koncentration

Dubbelsträngat DNA absorberar UV-ljus i proportion till sin koncentration, ett samband som kallas Beer–Lamberts lag. I en standardmätningsväg på 1 centimeter innehåller en lösning med ett A260-värde på 1,0 ungefär 50 ng/µL dubbelsträngat DNA. Detta tal, omräkningsfaktorn, omvandlar alla A260-värden till en koncentration:

DNA-koncentration (ng/µL) = A260 × 50 × spädningsfaktor

Spädningsfaktorn tar hänsyn till eventuell spädning som gjordes innan provet mättes. Ett prov som mättes utan spädning har spädningsfaktorn 1.

Så beräknas den totala DNA-mängden

När koncentrationen är känd kan den totala mängden DNA i provet beräknas utifrån dess volym:

Totalt DNA (µg) = koncentration (ng/µL) × volym (µL) ÷ 1000

Så beräknas DNA-koncentrationen: steg för steg

1. Blanda provet noggrant före mätningen. DNA kan fastna på rörväggarna eller sedimentera ojämnt.
2. Späd provet om det är starkt koncentrerat och sikta på ett A260-värde mellan 0,1 och 1,0. Spektrofotometerns avläsningar är minst tillförlitliga utanför detta intervall.
3. Nollställ spektrofotometern med samma buffert som användes för spädningen och mät sedan provet vid 260 nm.
4. Ange A260-värdet, provvolymen och spädningsfaktorn i kalkylatorn för att få koncentrationen och den totala mängden. Alla tre fält måste vara ifyllda, och volymen måste vara större än noll, innan ett resultat visas.

Räkneexempel

Exempel 1: outspätt prov

Ett A260-värde på 0,5, ingen spädning (spädningsfaktor 1) och en provvolym på 100 µL.

• Koncentration = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Totalt DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Exempel 2: utspätt prov

Ett rör innehåller 50 µL renat DNA. En liten del av det späddes 10-faldigt, och den utspädda delen gav ett A260-värde på 0,75. Spädningsfaktorn omvandlar detta värde tillbaka till koncentrationen i det ursprungliga röret, och 50 µL är volymen som anges vid beräkningen av den totala mängden.

• Koncentration = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Totalt DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Beräkning av spädningsfaktorn

Spädningsfaktor = total volym efter spädning ÷ volymen av det ursprungliga provet.

Om 5 µL DNA-lösning tillsätts till 45 µL buffert blir den totala volymen 50 µL, så spädningsfaktorn är 50 ÷ 5 = 10. Ett prov som inte späddes har spädningsfaktorn 1.

Typiska koncentrationsintervall för DNA

Koncentrationen beror på provtypen och extraktionsmetoden. Genomiskt DNA efter extraktion ligger vanligtvis mellan ungefär 10 och 100 ng/µL. Plasmid-DNA-preparationer ger ofta högre koncentrationer, ibland flera hundra ng/µL. Ett resultat som ligger långt utanför det förväntade intervallet för en viss metod kan tyda på problem med extraktionen eller själva mätningen.

Begränsningar vid mätning med UV-absorbans

Mätning av A260 går snabbt, men är inte den känsligaste eller mest specifika metoden för DNA. Proteiner, RNA och vissa buffertkomponenter absorberar också ljus nära 260 nm och kan höja avläsningen. Forskare kontrollerar ofta A260/A280-kvoten tillsammans med koncentrationen för att upptäcka proteinkontaminering; en kvot nära 1,8 visar vanligtvis att DNA-provet är rent. Metoder med fluorescerande färgämnen, såsom Qubit-analyser, binder endast till dubbelsträngat DNA och ger en noggrannare avläsning för utspädda eller orena prover, men kräver extra reagens och en fluorometer.

Vanliga frågor

Hur beräknar man DNA-koncentration från A260?

Multiplicera A260-värdet med 50, den standardiserade omräkningsfaktorn för dubbelsträngat DNA, och multiplicera sedan med spädningsfaktorn. Om provet inte späddes används spädningsfaktorn 1.

Vilken A260/A280-kvot är bra?

En kvot nära 1,8 visar vanligtvis att DNA-provet är rent. En lägre kvot tyder på proteinkontaminering. En kvot över 2,0 kan tyda på RNA-kontaminering.

Kan denna kalkylator användas för RNA?

Inte direkt, eftersom RNA använder omräkningsfaktorn 40 ng/µL i stället för 50. För att uppskatta RNA-koncentrationen multiplicerar man kalkylatorns resultat med 0,8 (40 ÷ 50), eller använder direkt A260 × 40 × spädningsfaktor.

Varför bör A260-värdet ligga mellan 0,1 och 1,0?

Absorbansen är ungefär proportionell mot koncentrationen, enligt Beer–Lamberts lag, huvudsakligen inom detta intervall. Utanför intervallet blir avläsningarna mindre tillförlitliga, så ett prov som är för koncentrerat eller för utspätt bör spädas eller koncentreras innan det mäts igen.

Vad är skillnaden mellan koncentration och renhet?

Koncentrationen anger hur mycket DNA som finns, i ng/µL. Renheten anger hur rent provet är och bedöms främst utifrån absorbanskvoter som A260/A280. Ett prov kan ha hög koncentration och ändå vara orent, eller låg koncentration och vara mycket rent.

Hur omvandlar jag ng/µL till µg/mL?

De två enheterna är numeriskt lika. 1 ng/µL motsvarar 1 µg/mL, eftersom både massenheten och volymenheten skalas med faktorn 1000.

Referenser

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3:e uppl.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.