DNA Kopieringsantal Kalkylator | Genomisk Analysverktyg

Kalkylator för DNA-kopietal

En kalkylator för DNA-kopietal uppskattar hur många kopior av en målsekvens som finns i ett DNA-prov. Den utgår från provets koncentration, dess volym och hur ofta målsekvensen förekommer i den längre DNA-sekvensen. Molekylärbiologiska laboratorier använder denna typ av uppskattning för att planera experiment som qPCR (kvantitativ polymeraskedjereaktion) innan de utför en dyrare och mer exakt analys.

Vad DNA-kopietal betyder

DNA-kopietal är antalet gånger en specifik sekvens förekommer i ett genom eller ett prov. En typisk mänsklig gen förekommer två gånger, en gång från varje förälder. Flera faktorer kan ändra detta antal.

• Amplifiering: mer än två kopior. Cancerceller amplifierar ofta gener som driver tillväxt, till exempel HER2 i vissa brösttumörer.
• Deletion: färre än två kopior, ibland noll. Deletioner kan orsaka genetiska sjukdomar.
• Duplicering: en extra kopia finns där det bara ska finnas en eller två.
• Variation i kopietal (CNV): en normal skillnad i kopietal mellan individer, som förekommer i en betydande del av det mänskliga genomet.

Formel för DNA-kopietal

Kalkylatorn omvandlar sekvensförekomster och provmassa till ett kopietal med denna formel:

$\text{Kopietal} = \frac{\text{Förekomster} \times \text{Koncentration} \times \text{Volym} \times N_A}{\text{DNA-längd} \times 660 \times 10^{9}}$

Där:

• Förekomster — hur många gånger målsekvensen förekommer i hela DNA-sekvensen, där överlappande träffar räknas separat.
• Koncentration — DNA-koncentrationen i nanogram per mikroliter (ng/μL), vanligtvis avläst med en spektrofotometer eller fluorometer.
• Volym — provvolymen i mikroliter (μL).
• $N_A$ — Avogadros tal, 6,022 × 10²³ molekyler per mol. Det omvandlar substansmängden DNA till ett antal molekyler.
• DNA-längd — längden på hela DNA-sekvensen, i baspar.
• 660 — den genomsnittliga molekylmassan för ett DNA-baspar, i gram per mol (g/mol). Ett baspar består av två parade nukleotider, en från varje DNA-sträng.
• 10⁹ — omvandlar nanogram till gram.

Formeln omvandlar först provets massa till antalet mol DNA-molekyler, multiplicerar med Avogadros tal för att få det totala antalet DNA-molekyler i provet och multiplicerar sedan med hur många gånger målsekvensen förekommer i varje molekyl.

Verktyget godtar endast bokstäverna A, T, C och G. Mellanslag och radbrytningar ignoreras, och gemener räknas på samma sätt som versaler.

Så beräknas DNA-kopietal: räkneexempel

Anta en DNA-sekvens på 12 baspar, ATCGATCGATCG, med en målsekvens på ATCG, en koncentration på 10 ng/μL och en volym på 20 μL.

Steg 1: Räkna förekomsterna. ATCG förekommer 3 gånger i ATCGATCGATCG (vid positionerna 1, 5 och 9).

Steg 2: Bestäm den totala DNA-massan. Koncentration × volym = 10 × 20 = 200 ng.

Steg 3: Omvandla till substansmängd. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Dividera med (12 baspar × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Det ger 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Steg 4: Omvandla till antal molekyler. Multiplicera med Avogadros tal: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekyler/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-molekyler.

Steg 5: Multiplicera med antalet förekomster. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, eller cirka 45 621 212 121 212 kopior.

Detta tal ser mycket stort ut eftersom ett prov på 20 μL med 10 ng/μL fortfarande innehåller biljoner korta DNA-molekyler. I riktiga prov används vanligtvis mycket längre sekvenser, vilket minskar antalet molekyler vid samma massa.

Användningsområden för analys av DNA-kopietal

Cancerdiagnostik. Patologilaboratorier kontrollerar HER2-kopietalet i brösttumörvävnad. En normal cell har två kopior. En amplifierad tumör kan ha sex eller fler, vilket påverkar möjligheten att behandlas med riktade läkemedel som trastuzumab.

Testning för genetiska sjukdomar. Tillstånd som DiGeorges syndrom innebär deletion av ett kromosomsegment. Downs syndrom innebär en extra kopia av kromosom 21 (trisomi 21). Att räkna kopior hjälper till att bekräfta dessa diagnoser.

Kvantifiering av transgener och plasmider. Forskare kontrollerar hur många kopior av en insatt gen som har införlivats i en växt-, djur- eller bakteriecell. En enda kopia föredras vanligtvis, eftersom flera kopior kan få cellen att stänga av genen.

Övervakning av patogenförekomst och virusmängd. Uppskattningar av kopietal visar hur mycket viralt eller bakteriellt DNA som finns i ett prov, vilket används vid infektionsövervakning och miljöanalyser.

Andra metoder för att mäta kopietal

Denna kalkylator ger en snabb uppskattning utifrån sekvens- och koncentrationsdata. Laboratorier som behöver högre precision använder vanligtvis någon av följande metoder:

• Kvantitativ PCR (qPCR): amplifierar och mäter DNA i realtid; noggrannheten är ungefär 15–20% med en bra standardkurva.
• Digital PCR (dPCR): delar upp ett prov i tusentals små reaktioner för direkt räkning, utan att en standardkurva behövs.
• Fluorescens in situ-hybridisering (FISH): räknar visuellt sekvenser direkt i celler eller kromosomer under mikroskop; standardmetoden i många laboratorier för cancerdiagnostik.
• Sekvensering av nästa generation (NGS): sekvenserar hela provet och kartlägger kopietalet i hela genomet på en gång.

Vanliga frågor

Vad är DNA-kopietal? Det är antalet gånger en viss DNA-sekvens förekommer i ett genom eller prov. De flesta mänskliga gener förekommer två gånger, en gång från varje förälder. Extra eller saknade kopior kan påverka hälsan och risken för sjukdom.

Hur exakt är denna kalkylator? Den ger en teoretisk uppskattning baserad på de angivna indata, inte en laboratoriemätning. Noggrannheten beror på hur exakt koncentrationen mättes och hur specifik målsekvensen är. Metoder som digital PCR är mer precisa för resultat som ska publiceras.

Kan denna kalkylator användas för RNA? Nej. RNA använder uracil i stället för tymin och har ett annat socker, så dess molekylmassa skiljer sig från DNA:s. RNA har en genomsnittlig molekylmassa på cirka 330 g/mol per nukleotid, jämfört med cirka 660 g/mol per DNA-baspar. Om DNA-formeln används på RNA-data blir svaret fel.

Varför räknas en överlappande sekvens mer än en gång? Kalkylatorn räknar varje position där målsekvensen matchar, även om träffarna delar bokstäver. I ATATAT matchar sekvensen ATA två gånger, vid position 1 och position 3, eftersom varje startposition kontrolleras separat.

Vilket koncentrationsintervall för DNA fungerar bäst? Koncentrationer på 10–100 ng/μL ger de mest tillförlitliga avläsningarna med vanliga laboratorieinstrument. Under 10 ng/μL ökar mätfelet, och en känsligare metod, till exempel fluorometrisk mätning, rekommenderas i stället för en vanlig spektrofotometer.

Kan denna kalkylator uppskatta plasmidkopietal? Ja. Ange hela plasmidsekvensen som DNA-sekvens och en unik region i den insatta sekvensen som målsekvens, tillsammans med den uppmätta plasmidkoncentrationen och provvolymen.