Proteinkoncentrationsberäknare | A280 till mg/mL

Kalkylator för proteinkoncentration

En proteinhaltskalkylator omvandlar en mätning av ljusabsorbans från en spektrofotometer till mängden protein som är löst i en lösning. Resultatet anges vanligtvis i milligram per milliliter (mg/mL) eller mikrogram per milliliter (μg/mL). Beräkningen bygger på Beer-Lamberts lag, ett samband inom kemin som kopplar hur mycket ljus ett prov absorberar till hur mycket av ett ämne det innehåller.

Så mäts proteinkoncentrationen

De flesta proteiner absorberar ultraviolett ljus starkt vid en våglängd på 280 nanometer (nm). Absorptionen kommer främst från två aminosyror, tryptofan och tyrosin, som finns i proteinets struktur. En spektrofotometer låter ljus passera genom provet och mäter hur mycket av ljuset som provet absorberar. Mätningen kallas absorbans, eller A280 när den görs vid 280 nm.

Att mäta absorbansen vid 280 nm går snabbt och förstör inte provet. Det skiljer metoden från kemiska metoder som Bradford- eller BCA-analysen, vilka beskrivs nedan. Metoden fungerar bäst för ett renat protein i lösning, med en absorbans mellan ungefär 0,1 och 1,0. Mätningar utanför detta intervall är mindre tillförlitliga, så provet kan behöva spädas före mätningen.

Formel för proteinkoncentration

Kalkylatorn omformar Beer-Lamberts lag för att lösa ut koncentrationen:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — proteinhalt i mg/mL
• A — absorbans vid 280 nm (ett rent tal utan enhet)
• DF — spädningsfaktor, hur många gånger det ursprungliga provet späddes före mätningen
• ε — extinktionskoefficient, en konstant som är specifik för proteinet, i L/(g·cm)
• l — optisk väglängd, den sträcka ljuset färdas genom provet, i cm (vanligen 1 cm i en standardkyvett, en liten behållare av glas eller plast som används i spektrofotometern)

Om resultatet ska omvandlas till mikrogram per milliliter multipliceras värdet i mg/mL med 1 000. Den totala proteinmassan i provet fås genom att multiplicera koncentrationen med provets volym i milliliter.

Löst exempel

Ett prov ger en absorbans på 0,5 vid 280 nm. Det späddes inte, så spädningsfaktorn är 1, och mätningen gjordes i en standardkyvett på 1 cm. Proteinet är bovint serumalbumin (BSA), som har en extinktionskoefficient på 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

I ett prov på 1 mL motsvarar det ungefär 0,75 mg totalt protein, eller 750 μg/mL.

Extinktionskoefficienter för vanliga proteiner

Varje protein absorberar ljus på olika sätt, eftersom de innehåller olika många tryptofan- och tyrosinrester. Extinktionskoefficienten beskriver detta för ett specifikt protein vid 280 nm, i enheten L/(g·cm). Vanliga värden är:

En kalkylator kan också använda en anpassad extinktionskoefficient för ett protein som inte finns med på listan. För ett protein med känd aminosyrasekvens kan värdet uppskattas med en formel som publicerades av Gill och von Hippel år 1989: ε₂₈₀ = (tryptofanrester × 5 500) + (tyrosinrester × 1 490) + (cystinrester × 125). Formeln ger ett resultat i M⁻¹cm⁻¹, en molär enhet som skiljer sig från de massbaserade värdena i L/(g·cm) ovan. Kostnadsfria verktyg som ProtParam, som tillhandahålls av ExPASy-servern, beräknar värdet direkt från en proteinsekvens.

Optisk väglängd och spädningsfaktor

Den optiska väglängden är bredden på kyvetten som innehåller provet, mätt i centimeter. Standardkyvetter är 1 cm breda. Spektrofotometrar för mikrovolymer, som mäter mycket små prov, kan använda en betydligt kortare ljusväg, till exempel 0,1 cm.

Spädningsfaktorn tar hänsyn till all spädning som gjorts före mätningen. Om ett koncentrerat prov skulle ge en absorbans över 1,0 är det vanligt att först späda det med buffert. Spädningsfaktorn är den totala spädda volymen dividerad med den ursprungliga provvolymen. Om exempelvis 10 μL prov blandas med 990 μL buffert blir den totala volymen 1 000 μL och spädningsfaktorn 100.

Andra sätt att mäta proteinhalt

Absorbans vid 280 nm är en av flera vanliga metoder som används i laboratoriet.

• Bradford-analys: använder ett färgämne som ändrar färg när det binder till protein. Den fungerar bra för prover som inte har renats, men färgförändringen kan variera mellan olika proteiner.
• BCA-analys: bygger på en färgförändring som orsakas av proteinets peptidbindningar. Den är förenlig med många detergenter, men tar längre tid att genomföra än en direkt absorbansmätning.
• Lowry-metoden: en äldre metod som är mycket känslig, men reagerar dåligt med vissa vanliga buffertbeståndsdelar.

Alla dessa tre metoder förstör provet. En direkt A280-mätning gör inte det, så samma prov kan tas till vara och användas igen.

Vanliga frågor och svar

Vilket är det ideala absorbansintervallet för metoden?

Mellan 0,1 och 1,0. Under 0,1 är mätningen oprecis. Över 1,0 kanske sambandet mellan absorbans och koncentration inte längre är linjärt, så provet bör spädas först.

Varför mäta vid 280 nm i stället för 260 nm?

Nukleinsyror, till exempel DNA och RNA, absorberar starkt vid 260 nm. Proteiner absorberar mer vid 280 nm på grund av sitt innehåll av tryptofan och tyrosin. Mätning vid 280 nm minskar störningen från eventuella nukleinsyror i provet.

Hur hittar man extinktionskoefficienten för ett protein som inte finns med på listan?

För ett protein med känd sekvens beräknar ett verktyg som ProtParam den utifrån antalet tryptofan-, tyrosin- och cystinrester. Den kan också mätas direkt genom att jämföra provets absorbans med absorbansen hos en lösning med känd koncentration.

Fungerar metoden för en blandning av proteiner?

Den fungerar bäst för ett enda, renat protein med känd extinktionskoefficient. En blandning av okända proteiner, till exempel ett celllysat, mäts vanligtvis i stället med Bradford- eller BCA-analys, eftersom dessa metoder ger en mer konsekvent uppskattning av den totala proteinmängden.

Kan detergenter störa mätningen?

Ja. Många detergenter absorberar ljus nära 280 nm, vilket kan förvränga resultatet. Ett blankprov som innehåller samma detergentkoncentration hjälper till att kompensera för denna bakgrundsabsorbans. Mycket höga detergentkoncentrationer kan kräva en detergentkompatibel analys, till exempel BCA.