Beer-Lambert Lag Kalkylator - Beräkna Absorbans Direkt

Vad är Beer–Lamberts lag?

Beer–Lamberts lag är en formel som beskriver hur mycket ljus en lösning absorberar. Den kopplar absorbansen till tre saker: hur koncentrerad lösningen är, hur starkt det lösta ämnet absorberar ljus och hur långt ljuset färdas genom provet. Den kallas också Beers lag. En kalkylator för Beer–Lamberts lag använder formeln för att beräkna absorbans, transmittans och den procentuella andelen absorberat ljus utifrån några enkla indata.

Lagen är ett centralt verktyg inom spektroskopi, läran om hur materia absorberar och avger ljus. Den används dagligen i kemi-, biologi- och medicinska laboratorier för att mäta koncentrationen av ämnen i en lösning.

Formel för Beer–Lamberts lag

Beer–Lamberts lag lyder:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A är absorbansen, alltså mängden ljus som en lösning absorberar vid en given våglängd. Den saknar enhet.
• ε (epsilon) är den molära absorptiviteten, även kallad molär extinktionskoefficient. Den mäter hur starkt ett ämne absorberar ljus vid en specifik våglängd. Enhet: L/(mol·cm).
• c är ämnets koncentration, i mol/L (molaritet).
• l är den optiska väglängden, alltså den sträcka ljuset färdas genom provet, i cm.

Absorbansen är relaterad till transmittansen, den andel ljus som passerar genom provet:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Här är T transmittansen, ett tal mellan 0 och 1. Om T multipliceras med 100 får man procentandelen transmitterat ljus. Procentandelen absorberat ljus är:

$\text{Procent absorberat ljus} = (1 - T) \times 100\%$

Till exempel betyder en absorbans på 1,0 att T = 0,1, så 90 % av ljuset absorberades. En absorbans på 2,0 betyder att T = 0,01, så 99 % absorberades.

Så beräknas absorbansen

För att beräkna absorbansen med kalkylatorn anger man tre värden:

1. Optisk väglängd (l) – provbehållarens bredd, vanligtvis en kyvett. De flesta standardkyvetter är 1 cm breda, men vissa specialkyvetter är 0,1 cm eller 10 cm breda.
2. Molär absorptivitet (ε) – en egenskap hos det specifika ämnet vid en specifik våglängd. Den finns vanligtvis i publicerade referenstabeller eller beräknas utifrån molekylens struktur. Proteiner absorberar till exempel ljus kring 280 nm på grund av två aminosyror, tryptofan och tyrosin, och det exakta värdet beror på hur många av dessa aminosyror proteinet innehåller.
3. Koncentration (c) – mängden löst ämne, i mol/L. Koncentrationer som anges i andra enheter, till exempel mg/mL, måste först omvandlas med hjälp av molekylens molmassa.

Kalkylatorn multiplicerar de tre talen med varandra för att få absorbansen och beräknar sedan transmittansen och procentandelen absorberat ljus utifrån resultatet.

Räkneexempel

En forskare renar ett protein och behöver kontrollera dess koncentration innan ett experiment genomförs. Proteinets molära absorptivitet vid 280 nm är känd från dess sekvens: ε = 44 000 L/(mol·cm). Forskaren mäter provet i en standardkyvett på 1 cm och avläser en absorbans på A = 0,523.

Omformning av formeln för att lösa ut koncentrationen:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Det motsvarar 11,9 mikromolar (μM). Detta ligger inom det intervall där instrument vanligtvis avläser mest noggrant, så forskaren kan lita på värdet utan att späda provet ytterligare.

Tolkning av absorbansvärden

• A = 0: inget ljus absorberas vid denna våglängd.
• A = 0,3 till 0,9: det intervall där de flesta spektrofotometrar ger de noggrannaste och mest linjära avläsningarna.
• A = 1,0: 90 % av ljuset absorberas och 10 % transmitteras.
• A = 2,0: 99 % absorberas och 1 % transmitteras.
• A över 2,5: ligger utanför de flesta instruments tillförlitliga intervall. Provet bör spädas och mätas igen.

Avläsningar under ungefär 0,3 påverkas av instrumentbrus. Avläsningar över ungefär 1,5 påverkas av små mängder ströljus inuti instrumentet, vilket ger upphov till fel. Att späda provet och mäta igen är den vanliga åtgärden när en avläsning ligger utanför det noggranna intervallet.

Var Beer–Lamberts lag används

Analytisk kemi. Laboratorier mäter absorbansen hos ett prov och använder formeln för att beräkna en okänd koncentration baklänges. Detta är vanligt vid mätning av nitrat-, fosfat- och metalljonhalter i vatten samt vid kontroll av koncentrationen i en kemikaliesats under tillverkningen.

Biokemi. Absorbans vid 280 nm används för att uppskatta proteinkoncentrationen. Absorbans vid 260 nm används för att uppskatta koncentrationen av DNA eller RNA; enligt konvention motsvarar en absorbans på 1,0 ungefär 50 μg/mL dubbelsträngat DNA eller 40 μg/mL RNA. Förhållandet mellan de två avläsningarna (A260/A280) ger ett grovt mått på provets renhet.

Läkemedel. Läkemedelstillverkare använder absorbansmätningar för att undersöka hur snabbt en tablett frisätter sitt verksamma ämne och för att följa hur ett läkemedel bryts ned under lagring.

Medicin. Många automatiserade blodanalysinstrument mäter absorbans från färgförändrande kemiska reaktioner för att rapportera nivåer av glukos, leverenzymer och bilirubin.

Mat och dryck. Ölfärg mäts genom absorbans vid 430 nm enligt metoden från European Brewery Convention (EBC). Liknande metoder används för att kontrollera färgen hos vin och läskedrycker.

Begränsningar hos Beer–Lamberts lag

Lagen förutsätter att ljuset har en enda, exakt våglängd och att provet inte sprider ljus. Den fungerar sämre i några vanliga situationer:

• Hög koncentration. Över ungefär 0,01 mol/L börjar de lösta molekylerna interagera med varandra, och absorbansen ökar inte längre linjärt med koncentrationen.
• Grumliga eller partikelhaltiga prov. Suspensioner och grumliga vätskor sprider ljus utöver att absorbera det, vilket gör absorbansavläsningen för hög. Beer–Lamberts lag tar inte hänsyn till ljusspridning; en relaterad modell som kallas Kubelka–Munk-teorin används för ogenomskinliga eller ljusspridande prov, till exempel pulver.
• Kemiska förändringar under mätningen. Vissa ämnen bryts ned av ljus eller förändras med pH-värdet medan de mäts, vilket ändrar avläsningen under mätningens gång.
• Temperaturförändringar. Den molära absorptiviteten beror på temperaturen, så avläsningar vid olika temperaturer kan inte jämföras direkt.

Historia

Lagen utvecklades under mer än ett århundrade genom tre forskares arbete. Pierre Bouguer beskrev år 1729 hur varje lika tjockt skikt av ett material absorberar samma andel av det ljus som passerar genom skiktet. Johann Heinrich Lambert formulerade detta samband matematiskt på nytt i sin bok Photometria från 1760 och visade att absorbansen ökar i direkt proportion till den optiska väglängden. August Beer utvidgade lagen 1852 och visade att absorbansen också ökar i direkt proportion till koncentrationen. Den sammanslagna lagen kallas ibland Bouguer–Beer–Lambert-lagen, som erkännande av alla tre forskarna.

Vanliga frågor

Vad används Beer–Lamberts lag till? Den beräknar hur mycket ljus en lösning absorberar och kan användas omvänt för att bestämma en okänd koncentration från en uppmätt absorbans. Därför utgör den grunden för UV-Vis-spektrofotometri, en vanlig laboratorieteknik för att mäta mängden av ett ämne i en lösning.

Vilka enheter använder Beer–Lamberts lag? Optisk väglängd anges i centimeter, molär absorptivitet i L/(mol·cm) och koncentration i mol/L. Absorbansen saknar själv enhet, även om den ibland anges som ”AU” för absorbansenheter. Om andra enheter förs in i formeln utan att först omvandlas blir svaret fel.

Varför är min absorbansavläsning inte proportionell mot koncentrationen? De vanligaste orsakerna är en koncentration över ungefär 0,01 mol/L, ett grumligt eller partikelhaltigt prov eller en avläsning långt utanför intervallet 0,3–0,9, där instrumenten är som noggrannast. Genom att späda provet och mäta igen kan man vanligtvis avgöra vilken orsak som gäller.

Vad är skillnaden mellan absorbans och transmittans? Transmittans är den andel ljus som passerar genom ett prov. Absorbans är den negativa logaritmen med basen 10 av transmittansen: A = −log₁₀(T). När absorbansen ökar minskar transmittansen.

Vad är skillnaden mellan absorbans och optisk densitet? De är samma storhet. ”Optisk densitet” används oftare inom biologi, medan ”absorbans” är vanligare inom kemi.

Vilket absorbansintervall är mest noggrant? Ungefär 0,3 till 0,9. Under detta intervall dominerar instrumentbruset signalen. Över ungefär 1,5 orsakar ströljus inuti instrumentet fel, och över ungefär 2,5 kan de flesta instrument inte ge en tillförlitlig avläsning alls.

Referenser

1. Beer, A. (1852). ”Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten.” Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). ”The Beer-Lambert Law.” Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S. och Popp, J. (2020). ”The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure.” ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.