เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA | เครื่องมือวัดปริมาณโปรตีน

Q: BCA assay ใช้ทำอะไร?

BCA assay ใช้วัดปริมาณโปรตีนทั้งหมดในตัวอย่าง คุณจะใช้เมื่อต้องการทราบปริมาณโปรตีน - ก่อนการทำ western blotting เพื่อให้แน่ใจว่าโหลดเท่ากัน ก่อนการทดสอบเอนไซม์เพื่อปรับค่ากิจกรรม ระหว่างการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์เพื่อติดตามผลผลิต หรือเมื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับ mass spectrometry นี่กลายเป็นวิธีมาตรฐานในการวัดปริมาณโปรตีนในห้องปฏิบัติการชีววิทยาระดับโมเลกุลและชีวเคมีเนื่องจากสามารถรองรับสารลดแรงตึงผิวและส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ที่มีในสารสกัดเซลล์ทั่วไป

Q: BCA assay มีความแม่นยำเพียงใด?

ภายใต้สภาวะที่ดี คาดหวังความแม่นยำ 5-10% ขึ้นอยู่กับการสร้างกราฟมาตรฐานที่ถูกต้อง (อย่างน้อย 5-6 จุด ครอบคลุมช่วงความเข้มข้นที่คาดหวัง) การใช้รีเอเจนต์ใหม่ และตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างไม่มีสารรบกวนที่ความเข้มข้นสูง องค์ประกอบของโปรตีนมีความสำคัญ - คอลลาเจนและเจลาตินให้ค่าสูงผิดปกติเนื่องจากองค์ประกอบกรดอะมิโน ในขณะที่ฮิสโตนให้ค่าต่ำ สำหรับการใช้งานส่วนใหญ่ ความคลาดเคลื่อน 5-10% เป็นที่ยอมรับได้และดีกว่าการโหลดตัวอย่างโดยไม่มีการวัดปริมาณใดๆ

Q: อะไรที่สามารถรบกวนผลของ BCA assay?

สารรีดิวซ์เป็นปัญหาหลัก - DTT, β-เมอร์แคปโตเอทานอล และกลูตาไธโอนจะรีดิวซ์ Cu²⁺ เป็น Cu¹⁺ โดยอิสระจากโปรตีน ทำให้ค่าอ่านสูงขึ้นผิดปกติ หากบัฟเฟอร์การแยกมีสารรีดิวซ์ ให้เจือจางตัวอย่างอย่างน้อย 1:10 เพื่อลดการรบกวน สารจับโลหะ (EDTA, EGTA) ทำงานในทิศทางตรงกันข้ามโดยการดึงไอออนทองแดง ลดการพัฒนาสี ความเข้มข้นสูงของน้ำตาลง่ายๆ ไขมัน และสารประกอบแอมโมเนียยังสามารถรบกวนได้ คู่มือทางเทคนิคของ Thermo Fisher's BCA protein assay มีตารางความเข้ากันได้อย่างครอบคลุม

Q: อะไรคือความแตกต่างระหว่าง BCA และ Bradford assays?

ความเร็วกับความเข้ากันได้ Bradford ให้ผลภายใน 5 นาที แต่ BCA ต้องใช้เวลาบ่ม 30 นาที แต่ Bradford ล้มเหลวเมื่อมีสารลดแรงตึงผิว - แม้แต่ 0.1% SDS ก็จะทำลายค่าอ่าน BCA ทนต่อ SDS, Triton X-100, NP-40 และสารลดแรงตึงผิวอื่นๆ ที่ใช้ในการแยกเซลล์ Bradford ยังแสดงความแปรปรวนระหว่างโปรตีนสูงเนื่องจากสีย้อม Coomassie จับกับกรดอะมิโนพื้นฐาน BCA มีความสม่ำเสมอมากขึ้นในโปรตีนประเภทต่างๆ สำหรับสารสกัดเซลล์ BCA มักเป็นตัวเลือกที่ดีกว่า สำหรับโปรตีนบริสุทธิ์ในบัฟเฟอร์ที่ปราศจากสารลดแรงตึงผิว ความเร็วของ Bradford ทำให้น่าสนใจ (ต่อในหน้าถัดไป...)

คำนวณปริมาตรตัวอย่างจากการอ่านค่าการดูดกลืนแสง BCA ได้ทันที รับปริมาตรการโหลดโปรตีนที่แม่นยำสำหรับเวสเทิร์นบลอต การทดสอบเอนไซม์ และการทดลอง IP

เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA การดูดกลืนแสง

คำนวณปริมาตรตัวอย่างที่แม่นยำจากค่าการดูดกลืนแสง BCA และมวลโปรตีนเป้าหมาย ป้อนค่าการดูดกลืนแสงและปริมาณโปรตีนที่ต้องการเพื่อรับปริมาตรที่แน่นอนสำหรับการโหลดที่สม่ำเสมอ

การกำหนดค่าเส้นโค้งมาตรฐาน

ประเภทเส้นโค้งมาตรฐาน

เส้นโค้งมาตรฐาน BCA

ข้อมูลตัวอย่าง

ตัวอย่าง 1

ชื่อตัวอย่าง

การดูดกลืนแสง BCA

มวลตัวอย่าง (μg)

ปริมาตรตัวอย่าง

—μL

สรุปผลลัพธ์

ชื่อตัวอย่าง	การดูดกลืนแสง	มวลตัวอย่าง (μg)	ความเข้มข้นโปรตีน (μg/μL)	ปริมาตรตัวอย่าง (μL)
ตัวอย่าง 1	—	—	—	—

สูตรการคำนวณ

ปริมาตรตัวอย่างคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

ปริมาตรตัวอย่าง (μL) = มวลตัวอย่าง (μg) / ความเข้มข้นโปรตีน (μg/μL)

เคล็ดลับการใช้งาน

• รักษาค่าการดูดกลืนแสงระหว่าง 0.1-2.0 เพื่อผลลัพธ์ที่แม่นยำภายในช่วงเชิงเส้น

• ปริมาณทั่วไป: 20-50 μg สำหรับ western blot, 500-1000 μg สำหรับ immunoprecipitation

• ปริมาตรเกิน 1000 μL บ่งชี้ว่ามีความเข้มข้นโปรตีนต่ำ - ควรทำการเข้มข้นตัวอย่าง

• BCA มาตรฐานใช้งานได้กับส่วนใหญ่ (20-2000 μg/mL) ใช้แบบเพิ่มประสิทธิภาพสำหรับตัวอย่างเจือจาง (5-250 μg/mL)

เครื่องคำนวณโหลด...

📚

เอกสารประกอบการใช้งาน

เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA สำหรับการหาปริมาณโปรตีนอย่างรวดเร็ว

เมื่อคุณเพิ่งเสร็จสิ้นการทดสอบ BCA และต้องการคำนวณว่าจะโหลดตัวอย่างเท่าไรสำหรับ western blot คุณกำลังเผชิญกับการคำนวณที่ง่ายในหลักการ แต่ยุ่งยากในทางปฏิบัติ วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตร เปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน คำนวณความเข้มข้นของโปรตีน แล้วจึงกำหนดปริมาตรที่ต้องการสำหรับมวลโปรตีนที่ต้องการ

เครื่องคำนวณนี้จัดการคณิตศาสตร์นี้ได้ทันที ป้อนค่าการดูดกลืนแสง BCA และปริมาณโปรตีนเป้าหมาย—คุณจะได้ปริมาตรตัวอย่างที่แน่นอนเป็นไมโครลิตร สิ่งที่ทำให้การทดสอบ BCA น่าเชื่อถือโดยเฉพาะคือความทนทานต่อสารซักล้างและสารลดแรงตึงผิวที่จะรบกวนวิธี Bradford หรือ Lowry เมื่อคุณทำงานกับเซลล์ไลเสทที่มี SDS หรือ Triton X-100 BCA ยังคงมีความแม่นยำในขณะที่วิธีอื่นล้มเหลว

วิธีการหาปริมาณโปรตีนด้วย BCA

หลักการของการทดสอบ BCA

การทดสอบ BCA (กรดไบซินโคนินิก) ทำงานผ่านปฏิกิริยาทองแดงสองขั้นตอน โปรตีนจะรีดิวซ์ Cu²⁺ เป็น Cu¹⁺ ภายใต้สภาวะด่าง ปริมาณการรีดิวซ์มีความสัมพันธ์โดยตรงกับความเข้มข้นของโปรตีน นี่คือจุดที่กรดไบซินโคนินิกเข้ามามีบทบาท: มันจะจับกับ Cu¹⁺ เพื่อสร้างสารเชิงซ้อนสีม่วงเข้มที่ดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตร

คุณวัดสีม่วงนี้ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ยิ่งสีม่วงเข้ม แสดงว่ามีโปรตีนมากขึ้น เปรียบเทียบค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างกับกราฟมาตรฐาน (โดยทั่วไปใช้มาตรฐาน BSA) และคุณจะได้ความเข้มข้นของโปรตีน ความน่าสนใจของ BCA คือสามารถทำงานได้อย่างน่าเชื่อถือแม้มีสารซักล้าง น้ำตาลรีดิวซ์ หรือส่วนประกอบบัฟเฟอร์อื่นๆ ซึ่งสารเหล่านี้จะรบกวนการทดสอบ Bradford หรือ Lowry

สูตรคำนวณปริมาตรตัวอย่าง

สูตรพื้นฐานสำหรับคำนวณปริมาตรตัวอย่างจากผลการดูดกลืนแสง BCA คือ:

$\text{ปริมาตรตัวอย่าง (ไมโครลิตร)} = \frac{\text{มวลตัวอย่าง (ไมโครกรัม)}}{\text{ความเข้มข้นโปรตีน (ไมโครกรัม/ไมโครลิตร)}}$

โดยที่:

ปริมาตรตัวอย่าง คือปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการ (ในไมโครลิตร)
มวลตัวอย่าง คือปริมาณโปรตีนที่ต้องการใช้ (ในไมโครกรัม)
ความเข้มข้นโปรตีน ได้มาจากการอ่านค่าการดูดกลืนแสง BCA (ในไมโครกรัม/ไมโครลิตร)

ความเข้มข้นโปรตีนคำนวณจากค่าการดูดกลืนแสงโดยใช้สมการกราฟมาตรฐาน:

$\text{ความเข้มข้นโปรตีน (ไมโครกรัม/ไมโครลิตร)} = \text{ความชัน} \times \text{การดูดกลืนแสง} + \text{จุดตัดแกน Y}$

สำหรับการทดสอบ BCA มาตรฐาน ความชันโดยทั่วไปประมาณ 2.0 และจุดตัดแกน Y มักใกล้ศูนย์ แต่ค่าเหล่านี้อาจแตกต่างกันขึ้นอยู่กับสภาวะการทดสอบและกราฟมาตรฐานของคุณ ตามโปรโตคอลวิธีการในเอนไซม์วิทยา การสร้างกราฟมาตรฐานด้วยจุดอย่างน้อย 5-6 จุดที่ครอบคลุมช่วงความเข้มข้นที่คาดหวังจะช่วยให้การหาปริมาณมีความแม่นยำในโปรตีนประเภทต่างๆ

การใช้เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA

เครื่องคำนวณนี้ช่วยลดขั้นตอนการคำนวณด้วยมือสำหรับแต่ละตัวอย่าง:

ป้อนการวัดของคุณ:
- ติดป้ายชื่อตัวอย่างของคุณ (มีประโยชน์เมื่อคำนวณปริมาตรสำหรับหลายตัวอย่างพร้อมกัน)
- ป้อนค่าการดูดกลืนแสงจากสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ที่ 562 นาโนเมตร
- ระบุปริมาณโปรตีนที่ต้องการเป็นไมโครกรัม (โดยทั่วไป 10-50 ไมโครกรัมสำหรับเวสเทิร์นบล็อต, 500-1000 ไมโครกรัมสำหรับอิมมูโนพรีซิพิเตชัน)
เลือกประเภทเส้นโค้งมาตรฐาน:
- BCA มาตรฐาน: โปรโตคอลทั่วไปที่สุด ใช้งานได้ในช่วง 20-2000 ไมโครกรัม/มล.
- BCA แบบเพิ่มความไวสูง: เพิ่มความไวสำหรับตัวอย่างที่เจือจาง (5-250 ไมโครกรัม/มล.)
- Micro BCA: รูปแบบไมโครเพลตเมื่อปริมาตรตัวอย่างจำกัด
- กำหนดเอง: ป้อนความชันและจุดตัดแกนของคุณเองหากคุณสร้างเส้นโค้งมาตรฐานแตกต่างออกไป
รับปริมาตรตัวอย่างของคุณ:
- เครื่องคำนวณจะแสดงปริมาตรไมโครลิตรที่คุณต้องปิเปตทันที
- เพิ่มหลายตัวอย่างเพื่อคำนวณทั้งเพลตพร้อมกัน
- คัดลอกผลลัพธ์ลงในสมุดบันทึกห้องปฏิบัติการหรือระบบ LIMS ของคุณ

ตัวอย่างในชีวิตจริง

สมมติว่าคุณกำลังเตรียมตัวอย่างสำหรับเวสเทิร์นบล็อตเพื่อเปรียบเทียบการแสดงออกของโปรตีนใน 6 สายพันธุ์เซลล์ คุณทำการทดสอบ BCA และพบว่าตัวอย่างหนึ่งมีค่าการดูดกลืนแสง 0.75 คุณต้องการโปรตีน 20 ไมโครกรัมต่อช่อง

โดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน (ความชัน = 2.0, จุดตัดแกน = 0):

ความเข้มข้นโปรตีน = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร
ปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการ = 20 ไมโครกรัม ÷ 1.5 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร = 13.33 ไมโครลิตร

ปิเปต 13.33 ไมโครลิตรของตัวอย่างนี้ เติมบัฟเฟอร์ที่ใช้โหลด และคุณจะได้โปรตีน 20 ไมโครกรัมอย่างแน่นอน ในขณะที่ตัวอย่างที่มีค่าการดูดกลืนแสง 1.2 จะต้องใช้เพียง 8.33 ไมโครลิตรสำหรับโปรตีน 20 ไมโครกรัม เครื่องคำนวณนี้ขจัดความจำเป็นในการคำนวณด้วยมือสำหรับแต่ละตัวอย่าง - เพียงป้อนค่าการอ่านและรับปริมาตรทั้งหมดในคราวเดียว

ความเข้าใจผลลัพธ์

เครื่องคำนวณนี้ให้ข้อมูลสำคัญหลายประการ:

ความเข้มข้นของโปรตีน: คำนวณจากค่าการดูดกลืนแสงของคุณโดยใช้กราฟมาตรฐาน แสดงถึงปริมาณโปรตีนต่อหน่วยปริมาตรในตัวอย่าง (μg/μL)
ปริมาตรตัวอย่าง: เป็นปริมาตรของตัวอย่างที่มีโปรตีนตามปริมาณที่ต้องการ ค่านี้จะใช้ในการเตรียมการทดลอง
คำเตือนและข้อแนะนำ: เครื่องคำนวณอาจให้คำเตือนสำหรับ:
- ค่าการดูดกลืนแสงที่สูงมาก (>3.0) ซึ่งอาจอยู่นอกช่วงเชิงเส้นของการทดสอบ
- ค่าการดูดกลืนแสงที่ต่ำมาก (<0.1) ซึ่งอาจใกล้กับขีดจำกัดการตรวจจับ
- ปริมาตรที่คำนวณได้ที่มีขนาดใหญ่เกินไป (>1000 μL) หรือเล็กเกินไป (<1 μL)

การประยุกต์ใช้ในห้องปฏิบัติการ

การเตรียมตัวอย่างสำหรับ Western Blot

การโหลดโปรตีนที่ไม่สม่ำเสมอเป็นสาเหตุหลักที่ทำให้ Western blot ให้ผลลัพธ์ที่ไม่น่าเชื่อถือ คุณอาจเห็นแถบที่เข้มในช่องหนึ่งและแถบที่จางในอีกช่องหนึ่ง—ไม่ใช่เพราะระดับการแสดงออกแตกต่างกัน แต่เป็นเพราะคุณโหลดปริมาณโปรตีนรวมที่ต่างกัน

วิธีแก้ไขทำได้ง่ายแต่ต้องคำนวณปริมาตรอย่างแม่นยำ เมื่อคุณได้ค่าการดูดกลืนของ BCA สำหรับทุกตัวอย่างแล้ว ให้กำหนดปริมาณโปรตีนที่จะโหลดในแต่ละช่อง (โดยปกติผมใช้ 20-30 ไมโครกรัมสำหรับโปรตีนที่มีปริมาณมาก สูงสุด 50 ไมโครกรัมสำหรับเป้าหมายที่มีปริมาณน้อย) คำนวณปริมาตรที่ต้องใช้สำหรับแต่ละตัวอย่าง จากนั้นทำให้เป็นมาตรฐานเดียวกันโดยปรับปริมาตรสุดท้ายด้วยบัฟเฟอร์การแตกเซลล์ก่อนเติมบัฟเฟอร์ Laemmli

ข้อผิดพลาดทั่วไป: ลืมว่าปริมาตรตัวอย่างเปลี่ยนแปลงหลังจากเติมบัฟเฟอร์การโหลด หากคุณกำลังโหลด 15 ไมโครลิตรทั้งหมด และบัฟเฟอร์การโหลดเป็น 4 เท่า คุณต้องใช้ 3.75 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์และ 11.25 ไมโครลิตรของการเจือจางตัวอย่าง วางแผนการเจือจางให้เหมาะสม

การทดสอบเอนไซม์

การวัดจลนศาสตร์ของเอนไซม์ต้องการปริมาณโปรตีนที่สม่ำเสมอในการทำซ้ำและเงื่อนไขต่างๆ เมื่อเปรียบเทียบกิจกรรมของเอนไซม์ระหว่างการรักษาเซลล์หรือตัวอย่างเนื้อเยื่อที่แตกต่างกัน คุณต้องทราบว่าเริ่มต้นด้วยปริมาณโปรตีนรวมเท่ากัน—มิฉะนั้น ความแตกต่างของกิจกรรมอาจสะท้อนเพียงความแตกต่างของความเข้มข้นของเอนไซม์

สำหรับการทดสอบเอนไซม์ ผมมักทำงานกับปริมาณโปรตีนที่ต่ำกว่า Western blot—มักจะเป็น 5-10 ไมโครกรัมต่อปฏิกิริยาสำหรับเอนไซม์ที่มีปริมาณมาก สิ่งสำคัญคือการรักษาความสม่ำเสมอนี้ในทุกเงื่อนไขและช่วงเวลา

การทดลอง Immunoprecipitation

การทดลอง IP สามารถใช้โปรตีนปริมาณมาก—โดยทั่วไปประมาณ 500-1000 ไมโครกรัมของไลเสทรวมต่อปฏิกิริยา เมื่อคุณกำลังดึงโปรตีนที่มีปริมาณน้อยหรือทดสอบแอนติบอดีหลายตัว คุณอาจดำเนินการ IP มากกว่าหนึ่งโหลในการทดลองเดียว

การเริ่มต้นด้วยปริมาณโปรตีนที่ไม่เท่ากันจะทำให้การทดลองทั้งหมดผิดพลาด หากตัวอย่างหนึ่งมี 800 ไมโครกรัมของอินพุต ในขณะที่อีกตัวอย่างมี 1200 ไมโครกรัม คุณไม่สามารถเปรียบเทียบปริมาณโปรตีนที่ร่วมตกตะกอนได้อย่างมีความหมาย คำนวณปริมาตรที่ต้องใช้สำหรับไลเสทแต่ละตัวอย่าง ทำให้เป็นมาตรฐานเดียวกันด้วยบัฟเฟอร์การแตกเซลล์ จากนั้นดำเนินการกับการบ่มแอนติบอดี นี่จะทำให้มั่นใจว่าความแตกต่างที่คุณเห็นใน Western blot สะท้อนความแตกต่างทางชีวภาพที่แท้จริง ไม่ใช่ความแปรปรวนของวัสดุเริ่มต้น

การทำบริสุทธิ์โปรตีน

การติดตามความเข้มข้นของโปรตีนตลอดขั้นตอนการทำบริสุทธิ์เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการคำนวณผลผลิตและระบุว่าส่วนใดมีโปรตีนเป้าหมายของคุณ โดยทั่วไปคุณจะทำการทดสอบ BCA บนส่วนของคอลัมน์เพื่อระบุส่วนที่มีความเข้มข้นสูงสุดและประเมินประสิทธิภาพการทำบริสุทธิ์

สิ่งที่เป็นประโยชน์ที่นี่: คำนวณโปรตีนรวมในแต่ละส่วน (ความเข้มข้น × ปริมาตร) เพื่อติดตามการกู้คืนตลอดแผนการทำบริสุทธิ์ หากคุณเริ่มต้นด้วย 500 มิลลิกรัมของโปรตีนรวมในไลเสทและสิ้นสุดด้วย 2 มิลลิกรัมของโปรตีนบริสุทธิ์ที่ 95% คุณจะกู้คืนโปรตีน 0.4% แต่เพิ่มความเข้มข้นของเป้าหมายอย่างมาก การคำนวณเหล่านี้จะช่วยในการปรับปรุงโปรโตคอลการทำบริสุทธิ์ของคุณ

คุณสมบัติขั้นสูงและข้อพิจารณา

เส้นโค้งมาตรฐานแบบกำหนดเอง

ขณะที่เครื่องคำนวณมีพารามิเตอร์เริ่มต้นสำหรับการทดสอบ BCA มาตรฐาน คุณยังสามารถป้อนค่าแบบกำหนดเองหากคุณสร้างเส้นโค้งมาตรฐานของตัวเอง ซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อ:

ทำงานกับตัวอย่างโปรตีนที่ไม่ใช่มาตรฐาน
ใช้โปรโตคอล BCA ที่ดัดแปลง
ทำงานในสภาพแวดล้อมที่มีสารที่อาจรบกวนการทดสอบ

เพื่อใช้เส้นโค้งมาตรฐานแบบกำหนดเอง:

เลือก "กำหนดเอง" จากตัวเลือกเส้นโค้งมาตรฐาน
ป้อนค่าความชันและจุดตัดแกน
เครื่องคำนวณจะใช้ค่าเหล่านี้สำหรับการคำนวณทั้งหมด

การจัดการหลายตัวอย่าง

เครื่องคำนวณช่วยให้คุณเพิ่มหลายตัวอย่างและคำนวณปริมาตรของพวกเขาพร้อมกัน ซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับการทดลองที่ต้องการการโหลดโปรตีนที่สม่ำเสมอในหลายเงื่อนไข

ประโยชน์ของการประมวลผลแบบกลุ่ม:

ประหยัดเวลาโดยการคำนวณปริมาตรทั้งหมดในคราวเดียว
สร้างความสม่ำเสมอในทุกตัวอย่าง
เปรียบเทียบความเข้มข้นโปรตีนระหว่างตัวอย่างได้ง่าย
ระบุค่าผิดปกติหรือข้อผิดพลาดในการวัด

การแก้ปัญหาปัญหาทั่วไป

การดูดกลืนแสงเกินช่วงเชิงเส้น

การอ่านค่าการดูดกลืนแสงเกิน 2.0 มักจะอยู่นอกช่วงเชิงเส้นของเส้นโค้งมาตรฐาน BCA ส่วนใหญ่ คุณจะพบสิ่งนี้กับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูง - โปรตีนบริสุทธิ์ สารสกัดนิวเคลียส หรือไลเซตที่ไม่ได้ทำการเจือจางอย่างเหมาะสม

วิธีแก้ปัญหาทำได้ง่าย: เจือจางตัวอย่าง 1:5 หรือ 1:10 ด้วยน้ำหรือบัฟเฟอร์ไลเซส ทำการทดสอบ BCA ใหม่ และคูณความเข้มข้นที่คำนวณได้ด้วยปัจจัยการเจือจาง อย่าพยายามประมาณค่านอกช่วงเชิงเส้นของเส้นโค้งมาตรฐาน - ความสัมพันธ์ระหว่างการดูดกลืนแสงและความเข้มข้นจะแตกสลายที่ความเข้มข้นสูง ซึ่งนำไปสู่การประเมินระดับโปรตีนต่ำกว่าความเป็นจริง

การดูดกลืนแสงต่ำใกล้ขีดตรวจจับ

เมื่อการดูดกลืนแสงลดลงต่ำกว่า 0.1 ความแม่นยำในการวัดจะเป็นปัญหา คุณอยู่ใกล้ขีดตรวจจับล่างที่ความแตกต่างเล็กน้อยในการอ่านค่าการดูดกลืนแสงจะแปลเป็นความแตกต่างขนาดใหญ่ในความเข้มข้นที่คำนวณ

สำหรับตัวอย่างที่เจือจาง ให้พิจารณาเปลี่ยนไปใช้โปรโตคอล BCA แบบเสริมหรือไมโคร ซึ่งให้ความไวสูงขึ้น หรือเข้มข้นตัวอย่างโดยใช้ตัวกรองแบบหมุน (Amicon หรือคล้ายกัน) หากจำเป็น ปรับแบบแผนการทดลองเพื่อทำงานกับโปรตีนปริมาณน้อย - หลายการประยุกต์ใช้งานสามารถทนต่อปริมาณการโหลดที่ต่ำกว่าที่คุณคาดคิด

การคำนวณปริมาตรที่ไม่มีเหตุผล

เครื่องคำนวณอาจแนะนำให้ดูดสารละลาย 150 ไมโครลิตร เมื่อความจุของหลุมสูงสุดคือ 30 ไมโครลิตร หรือแนะนำ 0.8 ไมโครลิตร ซึ่งต่ำกว่าช่วงการดูดสารที่แม่นยำของไมโครปิเปตต์ส่วนใหญ่

สำหรับปริมาตรขนาดใหญ่: เข้มข้นตัวอย่างโดยใช้ตัวกรองแบบหมุนหรือวิธีการตกตะกอน (TCA หรือการตกตะกอนแอซีโตน) สำหรับปริมาตรเล็ก: เจือจางตัวอย่าง (แล้วใช้ปริมาตรมากขึ้นตามสัดส่วน) หรือลดปริมาณโปรตีนเป้าหมายหากการทดลองของคุณอนุญาต

วิวัฒนาการของวิธีการวัดปริมาณโปรตีน

การวัดปริมาณโปรตีนได้พัฒนามาอย่างยาวนานนับตั้งแต่วิธีเคลดาห์ในปี 1883 ซึ่งต้องใช้การย่อยตัวอย่างในกรดซัลฟูริกเดือดเพื่อวัดปริมาณไนโตรเจน ห้องปฏิบัติการต้องการอุปกรณ์เฉพาะและความเชี่ยวชาญอย่างมากเพียงเพื่อประมาณความเข้มข้นของโปรตีน

วิธีการพัฒนาสู่การทดสอบ BCA สมัยใหม่

การทดสอบ ไบยูเรต (ต้นคริสต์ศตวรรษที่ 1900) นำการวิเคราะห์สีมาใช้ในการวัดปริมาณโปรตีน พันธะเปปไทด์จะรวมตัวกับไอออนทองแดงในสารละลายด่าง ทำให้เกิดสีม่วง เรียบง่าย แต่ไม่ค่อยไวต่อการตรวจวัด

โอลิเวอร์ โลว์รี่ปรับปรุงวิธีนี้ในปี 1951 โดยการรวมปฏิกิริยาไบยูเรตกับรีเอเจนต์โฟลิน-ซิโอคอลเต้า การทดสอบ โลว์รี่ ครอบงำการวัดปริมาณโปรตีนมาหลายทศวรรษ แต่มีจุดอ่อนสำคัญ: สารเคมีทั่วไปในห้องปฏิบัติการจำนวนมากรบกวนปฏิกิริยา—สารลดแรงตึงผิว EDTA แม้กระทั่งความเข้มข้นเกลือสูงก็สามารถทำให้การวัดคลาดเคลื่อนได้

วิธีของมาริออน แบรดฟอร์ดในปี 1976 โดยใช้ คูมาสซี บริลเลียนต์ บลู จี-250 เสนอความเร็ว—ได้ผลภายใน 5 นาทีแทน 30 นาที—แต่ก็นำมาซึ่งปัญหาของตัวเอง สีย้อมจับกับกรดอะมิโนด่างอย่างเจาะจง ดังนั้นองค์ประกอบโปรตีนส่งผลกระทบอย่างมากต่อค่าที่อ่าน สำคัญยิ่งไปกว่านั้น สารลดแรงตึงผิวที่ใช้ในการแตกเซลล์สามารถรบกวนการทดสอบโดยสิ้นเชิง

เข้าสู่การทดสอบ BCA ในปี 1985 พอล สมิธและคณะจาก Pierce Chemical Company ตระหนักว่ากรดไบซินโคนินิกสามารถตรวจจับไอออนทองแดง Cu¹⁺ ได้ไวกว่ารีเอเจนต์ไบยูเรตแบบดั้งเดิม นวัตกรรมของพวกเขาผสมผสานความทนทานของเคมีไบยูเรตต่อส่วนประกอบบัฟเฟอร์ต่าง ๆ กับความไวที่เพิ่มขึ้น สร้างวิธีการที่ทำงานได้อย่างน่าเชื่อถือแม้ในสภาพแวดล้อมที่มีสารลดแรงตึงผิว น้ำตาลรีดิวซ์ และสารอื่น ๆ ที่รบกวนการทดสอบแบรดฟอร์ดหรือโลว์รี่ นี่คือเหตุผลที่ BCA กลายเป็นมาตรฐานสำหรับการวัดปริมาณโปรตีนจากสารสกัดเซลล์—ทำงานได้ดีกับสภาพตัวอย่างในโลกแห่งความเป็นจริง

ตัวอย่างโค้ดสำหรับคำนวณปริมาตรตัวอย่าง

สูตร Excel

1=IF(B2<=0,"ข้อผิดพลาด: ค่าการดูดกลืนไม่ถูกต้อง",IF(C2<=0,"ข้อผิดพลาด: มวลตัวอย่างไม่ถูกต้อง",C2/(2*B2)))
2
3' โดยที่:
4' B2 ประกอบด้วยค่าการดูดกลืน
5' C2 ประกอบด้วยมวลตัวอย่างที่ต้องการในหน่วย μg
6' สูตรนี้จะส่งคืนปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการในหน่วย μL
7

การใช้งานใน Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """คำนวณความเข้มข้นของโปรตีนจากค่าการดูดกลืนโดยใช้กราฟมาตรฐาน"""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("ค่าการดูดกลืนต้องไม่เป็นลบ")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """คำนวณปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการโดยอ้างอิงจากค่าการดูดกลืนและมวลที่ต้องการ"""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("มวลตัวอย่างต้องเป็นบวก")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("ความเข้มข้นของโปรตีนที่คำนวณได้ต้องเป็นบวก")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# ตัวอย่างการใช้งาน
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"สำหรับค่าการดูดกลืน {absorbance} และมวลโปรตีนที่ต้องการ {sample_mass} μg:")
31    print(f"ความเข้มข้นของโปรตีน: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"ปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการ: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"ข้อผิดพลาด: {e}")
35

โค้ด R สำหรับการวิเคราะห์

1# ฟังก์ชันคำนวณความเข้มข้นของโปรตีนจากค่าการดูดกลืน
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("ค่าการดูดกลืนต้องไม่เป็นลบ")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# ฟังก์ชันคำนวณปริมาตรตัวอย่าง
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("มวลตัวอย่างต้องเป็นบวก")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("ความเข้มข้นของโปรตีนที่คำนวณได้ต้องเป็นบวก")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# ตัวอย่างการใช้งาน
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("สำหรับค่าการดูดกลืน %.2f และมวลโปรตีนที่ต้องการ %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("ความเข้มข้นของโปรตีน: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("ปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการ: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("ข้อผิดพลาด: %s\n", e$message))
39})
40

การใช้งานใน JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("ค่าการดูดกลืนต้องไม่เป็นลบ");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("มวลตัวอย่างต้องเป็นบวก");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("ความเข้มข้นของโปรตีนที่คำนวณได้ต้องเป็นบวก");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// ตัวอย่างการใช้งาน
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`สำหรับค่าการดูดกลืน ${absorbance} และมวลโปรตีนที่ต้องการ ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`ความเข้มข้นของโปรตีน: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`ปริมาตรตัวอย่างที่ต้องการ: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`ข้อผิดพลาด: ${error.message}`);
37}
38

การแสดงผลโค้งมาตรฐาน

ความสัมพันธ์ระหว่างการดูดกลืนแสงและความเข้มข้นของโปรตีนมักเป็นเส้นตรงภายในช่วงที่กำหนด ด้านล่างคือการแสดงผลโค้งมาตรฐาน BCA:

<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0.0

<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

การดูดกลืนแสง (562 nm) ความเข้มข้นของโปรตีน (μg/μL)

โค้งมาตรฐาน ตัวอย่างมาตรฐาน

โค้งมาตรฐาน BCA

การเปรียบเทียบกับวิธีการหาปริมาณโปรตีนอื่นๆ

วิธีการหาปริมาณโปรตีนต่างๆ มีข้อดีและข้อจำกัดที่แตกต่างกัน ต่อไปนี้คือการเปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์ BCA กับวิธีอื่นๆ ที่นิยม:

วิธี	ช่วงความไวในการตรวจวัด	ข้อดี	ข้อจำกัด	เหมาะสำหรับ
วิธีการวิเคราะห์ BCA	5-2000 ไมโครกรัม/มล.	• เข้ากันได้กับสารลดแรงตึงผิว • มีความแปรปรวนระหว่างโปรตีนน้อย • การพัฒนาสีมีความคงตัว	• ถูกรบกวนโดยสารรีดิวซ์ • ได้รับผลกระทบจากสารให้สารประกอบเชิงซ้อน	• การหาปริมาณโปรตีนทั่วไป • ตัวอย่างที่มีสารลดแรงตึงผิว
วิธีการวิเคราะห์แบรดฟอร์ด	1-1500 ไมโครกรัม/มล.	• รวดเร็ว (2-5 นาที) • มีสารรบกวนน้อย	• มีความแปรปรวนระหว่างโปรตีนสูง • เข้ากันไม่ได้กับสารลดแรงตึงผิว	• การวัดที่รวดเร็ว • ตัวอย่างที่ปราศจากสารลดแรงตึงผิว
วิธีโลวรี	1-1500 ไมโครกรัม/มล.	• เป็นที่ยอมรับมาเป็นเวลานาน • มีความไวดี	• มีสารรบกวนมาก • มีหลายขั้นตอน	• ความสอดคล้องทางประวัติศาสตร์ • ตัวอย่างโปรตีนบริสุทธิ์
การดูดกลืนแสง UV (280 นาโนเมตร)	20-3000 ไมโครกรัม/มล.	• ไม่ทำลายตัวอย่าง • รวดเร็วมาก • ไม่ต้องใช้สารเคมี	• ได้รับผลกระทบจากกรดนิวคลีอิก • ต้องใช้ตัวอย่างที่บริสุทธิ์	• สารละลายโปรตีนบริสุทธิ์ • การตรวจสอบอย่างรวดเร็วระหว่างการทำให้บริสุทธิ์
วิธีฟลูออเรสเซนต์	0.1-500 ไมโครกรัม/มล.	• มีความไวสูงสุด • ช่วงการวัดกว้าง	• สารเคมีราคาแพง • ต้องใช้เครื่องวัดฟลูออเรสเซนต์	• ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำมาก • ปริมาตรตัวอย่างจำกัด

คำถามที่พบบ่อย

BCA assay ใช้ทำอะไร?

BCA assay ใช้วัดปริมาณโปรตีนทั้งหมดในตัวอย่าง คุณจะใช้เมื่อต้องการทราบปริมาณโปรตีน - ก่อนการทำ western blotting เพื่อให้แน่ใจว่าโหลดเท่ากัน ก่อนการทดสอบเอนไซม์เพื่อปรับค่ากิจกรรม ระหว่างการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์เพื่อติดตามผลผลิต หรือเมื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับ mass spectrometry นี่กลายเป็นวิธีมาตรฐานในการวัดปริมาณโปรตีนในห้องปฏิบัติการชีววิทยาระดับโมเลกุลและชีวเคมีเนื่องจากสามารถรองรับสารลดแรงตึงผิวและส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ที่มีในสารสกัดเซลล์ทั่วไป

BCA assay มีความแม่นยำเพียงใด?

ภายใต้สภาวะที่ดี คาดหวังความแม่นยำ 5-10% ขึ้นอยู่กับการสร้างกราฟมาตรฐานที่ถูกต้อง (อย่างน้อย 5-6 จุด ครอบคลุมช่วงความเข้มข้นที่คาดหวัง) การใช้รีเอเจนต์ใหม่ และตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างไม่มีสารรบกวนที่ความเข้มข้นสูง องค์ประกอบของโปรตีนมีความสำคัญ - คอลลาเจนและเจลาตินให้ค่าสูงผิดปกติเนื่องจากองค์ประกอบกรดอะมิโน ในขณะที่ฮิสโตนให้ค่าต่ำ สำหรับการใช้งานส่วนใหญ่ ความคลาดเคลื่อน 5-10% เป็นที่ยอมรับได้และดีกว่าการโหลดตัวอย่างโดยไม่มีการวัดปริมาณใดๆ

อะไรที่สามารถรบกวนผลของ BCA assay?

สารรีดิวซ์เป็นปัญหาหลัก - DTT, β-เมอร์แคปโตเอทานอล และกลูตาไธโอนจะรีดิวซ์ Cu²⁺ เป็น Cu¹⁺ โดยอิสระจากโปรตีน ทำให้ค่าอ่านสูงขึ้นผิดปกติ หากบัฟเฟอร์การแยกมีสารรีดิวซ์ ให้เจือจางตัวอย่างอย่างน้อย 1:10 เพื่อลดการรบกวน สารจับโลหะ (EDTA, EGTA) ทำงานในทิศทางตรงกันข้ามโดยการดึงไอออนทองแดง ลดการพัฒนาสี ความเข้มข้นสูงของน้ำตาลง่ายๆ ไขมัน และสารประกอบแอมโมเนียยังสามารถรบกวนได้ คู่มือทางเทคนิคของ Thermo Fisher's BCA protein assay มีตารางความเข้ากันได้อย่างครอบคลุม

อะไรคือความแตกต่างระหว่าง BCA และ Bradford assays?

ความเร็วกับความเข้ากันได้ Bradford ให้ผลภายใน 5 นาที แต่ BCA ต้องใช้เวลาบ่ม 30 นาที แต่ Bradford ล้มเหลวเมื่อมีสารลดแรงตึงผิว - แม้แต่ 0.1% SDS ก็จะทำลายค่าอ่าน BCA ทนต่อ SDS, Triton X-100, NP-40 และสารลดแรงตึงผิวอื่นๆ ที่ใช้ในการแยกเซลล์ Bradford ยังแสดงความแปรปรวนระหว่างโปรตีนสูงเนื่องจากสีย้อม Coomassie จับกับกรดอะมิโนพื้นฐาน BCA มีความสม่ำเสมอมากขึ้นในโปรตีนประเภทต่างๆ สำหรับสารสกัดเซลล์ BCA มักเป็นตัวเลือกที่ดีกว่า สำหรับโปรตีนบริสุทธิ์ในบัฟเฟอร์ที่ปราศจากสารลดแรงตึงผิว ความเร็วของ Bradford ทำให้น่าสนใจ

(ต่อในหน้าถัดไป...)

การอ้างอิง

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, และคณะ "การวัดโปรตีนโดยใช้กรดไบซินโคนินิก" วารสารชีวเคมีวิเคราะห์. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific "ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA" คำแนะนำ. มีให้ที่: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM "การทดสอบกรดไบซินโคนินิก (BCA) สำหรับการหาปริมาณโปรตีน" ใน: Walker JM, บรรณาธิการ คู่มือโปรโตคอลโปรตีน. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J "การทดสอบเพื่อกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน" โปรโตคอลปัจจุบันในวิทยาศาสตร์โปรตีน. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ "การหาปริมาณโปรตีน" วิธีการในเอนไซม์วิทยา. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

เพิ่มประสิทธิภาพขั้นตอนการวัดปริมาณโปรตีน

การทดสอบ BCA ให้ค่าความเข้มข้นของโปรตีน แต่คุณยังต้องแปลงตัวเลขเหล่านั้นเป็นปริมาตรสำหรับการทดลองจริง เครื่องคำนวณนี้จัดการการแปลงทันที ไม่ว่าคุณจะเตรียมเวสเทิร์นบล็อตเพียงชุดเดียวหรือคำนวณปริมาตรสำหรับ 96 ตัวอย่างในคราวเดียว ป้อนค่าการดูดกลืนแสง ระบุปริมาณโปรตีนเป้าหมาย และรับปริมาตรที่แม่นยำสำหรับผลการทดลองที่สม่ำเสมอ