เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA | เครื่องมือวัดปริมาณโปรตีน

เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA คืออะไร

เครื่องคำนวณปริมาตรตัวอย่าง BCA แปลงค่าการดูดกลืนแสงจากการทดสอบโปรตีนด้วย BCA เป็นปริมาตรตัวอย่างหน่วยไมโครลิตร (μL) ที่ต้องใช้เพื่อโหลดโปรตีนตามปริมาณเป้าหมาย ใช้หลังทำการทดสอบโปรตีนด้วยกรดไบซินโคนิก (BCA) ซึ่งเป็นการทดสอบในห้องปฏิบัติการที่ใช้บ่อย โดยวัดปริมาณโปรตีนในสารละลายจากค่าการดูดกลืนแสงของสีม่วงที่ตัวอย่างพัฒนาขึ้น

การทดสอบ BCA วัดโปรตีนอย่างไร

การทดสอบ BCA ทำงานเป็นสองขั้นตอน ขั้นแรก โปรตีนในตัวอย่างจะรีดิวซ์ไอออนทองแดง (Cu²⁺) ให้เป็นรูปแบบอื่น (Cu¹⁺) ในสารละลายด่าง ปริมาณการรีดิวซ์ขึ้นอยู่กับปริมาณโปรตีนที่มีอยู่ ขั้นที่สอง กรดไบซินโคนินิกจะจับกับทองแดงที่ถูกรีดิวซ์และสร้างสารประกอบสีม่วง ซึ่งดูดกลืนแสงอย่างมากที่ความยาวคลื่น 562 นาโนเมตร (nm)

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์วัดปริมาณแสงที่ตัวอย่างดูดกลืนที่ 562 nm ค่านั้นเรียกว่าค่าการดูดกลืนแสง สีม่วงที่เข้มกว่าหมายถึงค่าการดูดกลืนแสงที่สูงกว่าและมีโปรตีนมากกว่า ห้องปฏิบัติการจะเปรียบเทียบค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละตัวอย่างกับเส้นโค้งมาตรฐาน ซึ่งสร้างจากการวัดความเข้มข้นที่ทราบค่าของโปรตีนอ้างอิง โดยทั่วไปคืออัลบูมินจากซีรัมวัว (BSA)

BCA เป็นที่นิยมเพราะยังใช้ได้เมื่อตัวอย่างมีสารลดแรงตึงผิว เช่น SDS หรือ Triton X-100 ซึ่งเป็นสารเคมีที่พบได้ทั่วไปในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ แต่รบกวนการทดสอบแบบเก่าอีกสองวิธี ได้แก่ วิธี Bradford และ Lowry

สูตรแปลงค่าการดูดกลืนแสง BCA เป็นปริมาตรตัวอย่าง

เส้นโค้งมาตรฐาน BCA เป็นเส้นตรงที่ปรับเข้ากับข้อมูล โดยแสดงค่าการดูดกลืนแสงเทียบกับความเข้มข้น:

$\text{ค่าการดูดกลืนแสง} = \text{ความชัน} \times \text{ความเข้มข้น} + \text{จุดตัดแกน}$

หากคำนวณย้อนกลับจากค่าการดูดกลืนแสงที่วัดได้ไปเป็นความเข้มข้นของโปรตีน จะกลับสมการได้ดังนี้:

$\text{ความเข้มข้นของโปรตีน (μg/μL)} = \frac{\text{ค่าการดูดกลืนแสง} - \text{จุดตัดแกน}}{\text{ความชัน}}$

เมื่อทราบความเข้มข้นแล้ว ปริมาตรตัวอย่างที่มีมวลโปรตีนตามเป้าหมายคือ:

$\text{ปริมาตรตัวอย่าง (μL)} = \frac{\text{มวลตัวอย่าง (μg)}}{\text{ความเข้มข้นของโปรตีน (μg/μL)}}$

เครื่องคำนวณมีประเภทเส้นโค้งที่กำหนดไว้ล่วงหน้าสี่แบบ แต่ละแบบมีความชันและจุดตัดแกนของตนเอง จุดตัดแกนเป็น 0 ในทุกแบบ เนื่องจากค่าที่อ่านได้ผ่านการหักแก้ค่าแบลงก์แล้ว (หักค่าการดูดกลืนแสงของตัวควบคุมที่ไม่มีโปรตีนออกก่อน) ความชันสะท้อนว่าวิธีการแต่ละแบบครอบคลุมช่วงการดูดกลืนแสงของเพลตมากน้อยเพียงใด

วิธีที่มีความไวสูงกว่าและออกแบบมาสำหรับตัวอย่างเจือจาง จะให้ค่าการดูดกลืนแสงต่อไมโครกรัมของโปรตีนมากกว่า จึงมีความชันสูงกว่า Enhanced BCA และ Micro BCA เหมาะสำหรับตัวอย่างที่เจือจางเกินกว่าวิธีมาตรฐานจะวัดได้อย่างแม่นยำ

วิธีคำนวณปริมาตรตัวอย่างจากค่าการดูดกลืนแสง BCA

1. ทำการทดสอบ BCA และอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 nm ของแต่ละตัวอย่าง
2. เลือกประเภทเส้นโค้งให้ตรงกับวิธีที่ใช้ (Standard, Enhanced หรือ Micro) หรือป้อนค่าความชันและจุดตัดแกนแบบกำหนดเองจากเส้นโค้งที่สร้างขึ้นในวันนั้น
3. ป้อนค่าการดูดกลืนแสงและมวลโปรตีนเป้าหมายเป็นไมโครกรัมของแต่ละตัวอย่าง
4. เครื่องคำนวณจะแปลงค่าการดูดกลืนแสงเป็นความเข้มข้นของโปรตีน จากนั้นหารมวลเป้าหมายด้วยความเข้มข้นนั้นเพื่อหาปริมาตรที่ต้องดูดด้วยปิเปต

ตัวอย่าง: การคำนวณปริมาตรตัวอย่างจากค่าการดูดกลืนแสง BCA

นักวิจัยที่เตรียมเวสเทิร์นบลอตต้องการโปรตีน 20 μg ต่อเลน และใช้เส้นโค้ง BCA มาตรฐาน (ความชัน 1.0 จุดตัดแกน 0)

ตัวอย่าง A มีค่าการดูดกลืนแสง 0.75:

• ความเข้มข้นของโปรตีน = (0.75 − 0) / 1.0 = 0.75 μg/μL
• ปริมาตรตัวอย่าง = 20 μg ÷ 0.75 μg/μL = 26.67 μL

ตัวอย่าง B มีค่าการดูดกลืนแสง 1.2:

• ความเข้มข้นของโปรตีน = (1.2 − 0) / 1.0 = 1.2 μg/μL
• ปริมาตรตัวอย่าง = 20 μg ÷ 1.2 μg/μL = 16.67 μL

ตัวอย่าง A เจือจางมากกว่า จึงต้องใช้ปริมาตรมากกว่าเพื่อให้ได้ปริมาณเป้าหมาย 20 μg เท่ากัน

การทำความเข้าใจผลลัพธ์จากเครื่องคำนวณ

เครื่องคำนวณรายงานตัวเลขสองค่าในแต่ละตัวอย่าง ได้แก่ ความเข้มข้นของโปรตีนหน่วย μg/μL และปริมาตรตัวอย่างหน่วย μL นอกจากนี้ยังแจ้งเตือนผลลัพธ์ที่อาจก่อให้เกิดปัญหา:

• ค่าการดูดกลืนแสงที่สูงกว่า 3.0 จะเรียกใช้คำเตือน เนื่องจากค่าที่อ่านได้ในการทดสอบ BCA โดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 0 ถึง 2.0
• ค่าการดูดกลืนแสงที่ต่ำกว่า 0.05 (แต่สูงกว่าศูนย์) จะเรียกใช้คำเตือนว่าผลลัพธ์อาจมีความแม่นยำน้อยลง เนื่องจากสัญญาณต่ำไวต่อสัญญาณรบกวนจากการวัดมากกว่า
• ปริมาตรที่คำนวณได้ตั้งแต่ 1000 μL ขึ้นไปจะเรียกใช้คำเตือนให้ใช้ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงกว่า
• ปริมาตรที่คำนวณได้ต่ำกว่า 0.5 μL จะเรียกใช้คำเตือนว่าอาจดูดปริมาตรได้ไม่แม่นยำ
• ค่าการดูดกลืนแสงติดลบหรือมวลตัวอย่างติดลบจะถูกปฏิเสธโดยทันที

การใช้งานจริงในห้องปฏิบัติการ

การโหลดโปรตีนให้สม่ำเสมอเป็นหนึ่งในจุดที่มักทำให้เกิดความผิดพลาดในการทำเวสเทิร์นบลอต ความเข้มของแถบที่ไม่เท่ากันระหว่างเลนมักสะท้อนการโหลดโปรตีนไม่เท่ากัน ไม่ใช่ความแตกต่างที่แท้จริงของการแสดงออก การคำนวณปริมาตรที่แน่นอนสำหรับแต่ละตัวอย่างโดยอิงจากค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างนั้น ช่วยให้การโหลดโปรตีนในเจลสม่ำเสมอ

การคำนวณแบบเดียวกันใช้กับการทดสอบเอนไซม์ ซึ่งการเปรียบเทียบกิจกรรมระหว่างสภาวะต่าง ๆ ต้องเริ่มจากปริมาณโปรตีนรวมที่เท่ากัน และใช้กับอิมมูโนพรีซิพิเทชัน ซึ่งโปรตีนตั้งต้นที่ไม่เท่ากัน (เช่น 800 μg ในหลอดหนึ่งเทียบกับ 1200 μg ในอีกหลอด) ทำให้เปรียบเทียบผลได้ยาก ระหว่างการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ จะใช้สูตรเดียวกันในแต่ละขั้นตอนเพื่อติดตามว่าโปรตีนเหลืออยู่ในแต่ละส่วนมากน้อยเพียงใด

การเปรียบเทียบกับการทดสอบโปรตีนวิธีอื่น

ประวัติโดยย่อของการหาปริมาณโปรตีน

การวัดโปรตีนในยุคแรกอาศัยวิธี Kjeldahl (1883) ซึ่งวัดปริมาณไนโตรเจนหลังย่อยตัวอย่างด้วยกรด การทดสอบไบยูเรตที่พัฒนาขึ้นในช่วงต้นคริสต์ทศวรรษ 1900 ใช้ปฏิกิริยาสีระหว่างพันธะเพปไทด์กับไอออนทองแดง แต่มีความไวไม่สูงนัก Oliver Lowry ผสานปฏิกิริยาไบยูเรตเข้ากับรีเอเจนต์เพิ่มเติมใน 1951 จนเกิดเป็นวิธี Lowry ซึ่งครองการวัดโปรตีนอยู่นานหลายทศวรรษ แม้ถูกรบกวนโดยสารเคมีในห้องปฏิบัติการทั่วไป เช่น สารลดแรงตึงผิวและ EDTA Marion Bradford นำเสนอวิธีที่เร็วกว่าโดยอาศัยการจับกับสีย้อมใน 1976 แต่ก็ถูกรบกวนเมื่อมีสารลดแรงตึงผิว และผลยังแตกต่างกันตามองค์ประกอบกรดอะมิโนของโปรตีน Paul Smith และคณะจากบริษัท Pierce Chemical Company ตีพิมพ์วิธี BCA ใน 1985 โดยผสานเคมีของไบยูเรตเข้ากับความไวต่อทองแดงที่สูงกว่าของกรดไบซินโคนินิก ทำให้ได้การทดสอบที่ทนต่อสารลดแรงตึงผิวซึ่งพบในสารสกัดเซลล์ทั่วไป

ตัวอย่างโค้ด

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

คำถามที่พบบ่อย

การทดสอบ BCA ใช้ทำอะไร? ใช้วัดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดในสารละลาย โดยมักทำก่อนโหลดโปรตีนในปริมาณเท่ากันสำหรับเวสเทิร์นบลอต ก่อนปรับมาตรฐานการทดสอบกิจกรรมเอนไซม์ หรือระหว่างติดตามผลได้จากการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์

การทดสอบ BCA มีความแม่นยำเพียงใด? ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม ผลมักมีความแม่นยำภายในช่วง 5–10% โดยเส้นโค้งมาตรฐานต้องมีอย่างน้อยห้าหรือหกจุด และตัวอย่างต้องไม่มีสารรบกวนความเข้มข้นสูง

อะไรที่รบกวนผลการทดสอบ BCA? สารรีดิวซ์ ซึ่งรวมถึง DTT และเบตา-เมอร์แคปโตเอทานอล ทำให้ค่าการดูดกลืนแสงสูงขึ้นเทียม เนื่องจากสารเหล่านี้รีดิวซ์ทองแดงได้เองโดยไม่ขึ้นกับโปรตีน ส่วนสารคีเลต เช่น EDTA จะลดค่าการดูดกลืนแสงด้วยการจับกับทองแดงก่อนที่ทองแดงจะทำปฏิกิริยา

การทดสอบ BCA และ Bradford แตกต่างกันอย่างไร? Bradford ให้ผลภายในประมาณห้านาที แต่ถูกรบกวนโดยสารชะล้างและทำปฏิกิริยาแตกต่างกันตามองค์ประกอบกรดอะมิโนของโปรตีน BCA ใช้เวลาประมาณ 30 นาที แต่ทนต่อสารชะล้างและให้ค่าที่สม่ำเสมอกว่าในโปรตีนต่างชนิด จึงเหมาะกว่าสำหรับสารสกัดเซลล์

เหตุใดปริมาตรตัวอย่างที่คำนวณได้จึงมากผิดปกติ? ปริมาตรที่มากหมายความว่าความเข้มข้นของโปรตีนที่วัดได้ต่ำกว่าที่คาด สาเหตุที่พบบ่อย ได้แก่ การสลายเซลล์ไม่สมบูรณ์ ตัวอย่างเจือจางมากเกินไป หรือค่าการดูดกลืนแสงใกล้ขีดจำกัดการตรวจวัดต่ำของการทดสอบ การทำให้ตัวอย่างเข้มข้นขึ้นด้วยตัวกรองแบบแรงเหวี่ยง หรือเปลี่ยนไปใช้วิธี Enhanced BCA หรือ Micro BCA มักช่วยแก้ปัญหาได้

ควรทำอย่างไรหากค่าการดูดกลืนแสงอยู่นอกช่วงเชิงเส้น? เจือจางตัวอย่างแล้ววัดซ้ำ ความสัมพันธ์ระหว่างค่าการดูดกลืนแสงกับความเข้มข้นจะไม่เป็นไปตามเดิมเมื่อสูงกว่าประมาณ 2.0 ดังนั้นการประมาณค่านอกช่วงเส้นโค้งมาตรฐานจะประเมินความเข้มข้นจริงต่ำเกินไป

เอกสารอ้างอิง

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT และคณะ “การวัดโปรตีนโดยใช้กรดไบซินโคนิก” Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85
2. Thermo Fisher Scientific. “ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA” คู่มือผู้ใช้ (MAN0011430)
3. Bradford MM. “วิธีที่รวดเร็วและไวต่อการตรวจวัดสำหรับการหาปริมาณโปรตีนระดับไมโครกรัม” Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254