Ct değerleri ve seyreltme faktörlerinden PCR verimliliğini hesaplayın. Standart eğrileri analiz edin, amplifikasyon verimliliğini belirleyin ve niceliksel PCR deneylerinizi doğrulayın.
Değer pozitif olmalıdır
Değer pozitif olmalıdır
Değer pozitif olmalıdır
Değer pozitif olmalıdır
Değer pozitif olmalıdır
Grafik oluşturmak için geçerli veriler girin
qPCR verimliliği, PCR reaksiyonunun ne kadar iyi çalıştığını ölçen bir değerdir. %100 verimlilik, PCR ürün miktarının her döngüde iki katına çıktığı anlamına gelir.
Verimlilik, Ct değerlerinin başlangıç şablon konsantrasyonunun logaritması (seyreltme serisi) ile çizilmesiyle elde edilen standart eğrinin eğiminden hesaplanır.
Verimlilik (E) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
E = 10^(-1/slope) - 1
Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) verimliliği, qPCR deneylerinizin doğruluğunu ve güvenilirliğini doğrudan etkileyen kritik bir parametredir. qPCR verimliliği hesaplayıcısı, araştırmacıların PCR reaksiyonlarının her termal döngüde hedef DNA dizilerini ne kadar verimli bir şekilde çoğalttığını belirlemelerine yardımcı olur. İdeal qPCR reaksiyonları, her döngüde yaklaşık olarak PCR ürün miktarının iki katına çıktığını gösteren %90-110 arasında bir verimlilik göstermelidir.
Kötü amplifikasyon verimliliği, yanlış nicelendirme, güvenilir olmayan sonuçlar ve hatalı deneysel sonuçlara yol açabilir. qPCR verimliliğinizi hesaplayarak ve izleyerek, reaksiyon koşullarını optimize edebilir, primer tasarımlarını doğrulayabilir ve nicel PCR verilerinizin kalitesini sağlayabilirsiniz.
Bu hesaplayıcı, standart eğri yöntemini kullanarak, döngü eşiği (Ct) değerlerini şablon konsantrasyonunun logaritması (seri seyreltmelerle temsil edilir) ile karşılaştırarak qPCR denemenizin verimliliğini belirler. Bu standart eğrinin elde edilen eğimi, basit bir matematiksel formül kullanılarak PCR amplifikasyon verimliliğini hesaplamak için kullanılır.
Bir qPCR reaksiyonunun verimliliği, standart eğrinin eğiminden aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
Burada:
%100 verimliliğe sahip ideal bir PCR reaksiyonu için (her döngüde ampliconların mükemmel iki katına çıkması), eğim -3.32 olacaktır. Bu, şu şekilde ifade edilir:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (veya %100)}
Verimlilik yüzdesi, ondalık verimliliği 100 ile çarparak hesaplanır:
\text{Verimlilik (%)} = E \times 100\%
Standart eğri, Ct değerlerini (y ekseni) başlangıç şablon konsantrasyonu veya seyreltme faktörünün logaritması (x ekseni) ile karşılaştırarak oluşturulur. Bu değişkenler arasındaki ilişki doğrusal olmalıdır ve bu doğrusal ilişkinin kalitesi, belirleme katsayısı (R²) kullanılarak değerlendirilir.
Güvenilir qPCR verimliliği hesaplamaları için:
Veri hazırlığı: Hesaplayıcı, her seyreltme noktası için Ct değerlerinizi ve seyreltme faktörünü girdi olarak alır.
Log dönüşümü: Seyreltme serisi logaritmik ölçeğe (log taban 10) dönüştürülür.
Doğrusal regresyon: Hesaplayıcı, log-dönüştürülmüş veriler üzerinde doğrusal regresyon analizi yaparak eğimi, y-kesişimini ve R² değerini belirler.
Verimlilik hesaplama: Eğim değerini kullanarak verimlilik, E = 10^(-1/eğim) - 1 formülü ile hesaplanır.
Sonuç yorumlama: Hesaplayıcı, verimliliği yüzde olarak ve eğim ile R² değerini göstererek qPCR denemenizin güvenilirliğini değerlendirmenize yardımcı olur.
qPCR verimliliğinizi hesaplamak için bu adımları izleyin:
Seyreltme sayısını ayarlayın: Standart eğrinizde kaç seyreltme noktanız olduğunu seçin (3-7 nokta önerilir).
Seyreltme faktörünü girin: Ardışık örnekler arasındaki seyreltme faktörünü girin (örneğin, 10 için 10 kat seyreltme serisi, 5 için 5 kat seyreltme serisi).
Ct değerlerini girin: Her seyreltme noktası için Ct değerlerini girin. Genellikle, ilk seyreltme (Seyreltme 1) en yüksek şablon konsantrasyonunu içerir ve en düşük Ct değerini verir.
Sonuçları görüntüleyin: Hesaplayıcı otomatik olarak hesaplanmış değerleri gösterecektir:
Sonuçları yorumlayın: qPCR verimliliğinizin kabul edilebilir aralıkta (90-110%) olup olmadığını ve R² değerinin güvenilir bir standart eğriyi gösterip göstermediğini değerlendirin (≥ 0.98).
Sonuçları kopyalayın: Hesaplanan tüm değerleri kayıtlarınız veya yayınlarınız için kopyalamak için "Sonuçları Kopyala" butonunu kullanın.
Bir örneği inceleyelim:
Bir standart eğri üzerine çizildiğinde:
Hesaplayıcı, doğrusal regresyon yapacak ve şunları belirleyecektir:
Verimlilik formülünü kullanarak:
Bu, %93'lük iyi bir qPCR verimliliğini gösterir ve bu da kabul edilebilir 90-110% aralığına girmektedir.
Yeni bir primer çiftini nicel deneyler için kullanmadan önce, performansını doğrulamak önemlidir. qPCR verimliliğini hesaplamak:
Yeni qPCR denemeleri geliştirirken, verimlilik hesaplamaları kritik öneme sahiptir:
Göreli nicelendirme deneylerinde, PCR verimliliğini bilmek önemlidir:
Klinik ve tanısal ortamlarda, qPCR verimliliği önemlidir:
Çevresel ve gıda güvenliği uygulamalarında, verimlilik hesaplamaları yardımcı olur:
Standart eğri yöntemi, qPCR verimliliğini hesaplamak için en yaygın yaklaşımdır, ancak alternatif yöntemler de vardır:
Bu yöntem, bir seferde bir amplifikasyon eğrisinin fluoresan verilerinden verimliliği hesaplar ve bir seyreltme serisi gerektirmez. LinRegPCR gibi yazılımlar, bireysel reaksiyonların eksponensiyel aşamasını analiz ederek verimliliği belirler.
Avantajlar:
Dezavantajlar:
Dijital PCR (dPCR), standart eğri veya verimlilik hesaplamaları gerektirmeden kesin nicelendirme sağlar.
Avantajlar:
Dezavantajlar:
Bazı qPCR analiz yazılımları, tam bir standart eğri olmadan verimliliği tahmin eden karşılaştırmalı nicelendirme yöntemleri sunar.
Avantajlar:
Dezavantajlar:
qPCR ve verimlilik hesaplamalarının geliştirilmesi, son birkaç on yılda önemli ölçüde evrim geçirmiştir:
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Kary Mullis tarafından 1983 yılında icat edilmiştir ve moleküler biyolojiyi devrim niteliğinde değiştirmiştir. Ancak, geleneksel PCR yalnızca nitel veya yarı-nitel olarak kullanılıyordu. İlk gerçek zamanlı PCR sistemi, Russell Higuchi ve meslektaşları tarafından 1990'ların başında geliştirilmiştir; bu sistem, PCR ürünlerinin birikimi izlenerek (etidyum bromür fluoresansı kullanarak) nicel bilgi sağlanabileceğini göstermiştir.
qPCR teknolojisi geliştikçe, standartlaştırma ve doğrulama önem kazandı. PCR verimliliği kavramı, güvenilir nicelendirme için merkezi bir konu haline geldi:
Alan, aşağıdaki gelişmelerle evrimini sürdürdü:
Bugün, qPCR verimliliğini hesaplamak ve raporlamak, güvenilir qPCR verileri yayınlamak için gerekli kabul edilmektedir ve bu hesaplayıcı gibi araçlar, araştırmacıların alandaki en iyi uygulamalara uymalarına yardımcı olmaktadır.
1' Eğim hücre A2'de ise B2 hücresine yerleştirin
2=10^(-1/A2)-1
3
4' Verimlilik ondalık B2 hücresinde ise C2 hücresine yerleştirin
5=B2*100
6
7' Ct değerleri ve seyreltme faktörü ile verimlilik hesaplamak için fonksiyon
8Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
9 Dim i As Integer
10 Dim n As Integer
11 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
12 Dim logDilution As Double, slope As Double
13
14 n = CtValues.Count
15
16 ' Doğrusal regresyonu hesapla
17 For i = 1 To n
18 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
19 sumX = sumX + logDilution
20 sumY = sumY + CtValues(i)
21 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
22 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
23 Next i
24
25 ' Eğim hesapla
26 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
27
28 ' Verimliliği hesapla
29 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
30End Function
311# Ct değerleri ve seyreltme faktörü ile qPCR verimliliğini hesaplamak için R fonksiyonu
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Log seyreltme değerlerini oluştur
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Doğrusal regresyonu gerçekleştir
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Eğim ve R-kareyi al
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Verimliliği hesapla
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Sonuçları döndür
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Örnek kullanım
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Verimlilik: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Eğim: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kare: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Ct değerleri ve seyreltme faktöründen qPCR verimliliğini hesapla.
8
9 Parametreler:
10 ct_values (list): Ct değerlerinin listesi
11 dilution_factor (float): Ardışık örnekler arasındaki seyreltme faktörü
12
13 Döndürür:
14 dict: Verimlilik, eğim, r_kare ve y-kesişimi içeren sözlük
15 """
16 # Log seyreltme değerlerini oluştur
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Doğrusal regresyonu gerçekleştir
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Verimliliği hesapla
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Standart eğriyi regresyon çizgisi ile çizin.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Regresyon çizgisi için noktalar oluştur
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Seyreltme')
48 plt.ylabel('Ct Değeri')
49 plt.title('qPCR Standart Eğrisi')
50
51 # Eğri ve R²'yi grafiğe ekle
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Verimlilik = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Örnek kullanım
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Verimlilik: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Eğim: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kare: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-kesişimi: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Standart eğriyi çiz
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Ct değerleri ve seyreltme faktöründen qPCR verimliliğini hesapla
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct değerlerinin dizisi
4 * @param {number} dilutionFactor - Ardışık örnekler arasındaki seyreltme faktörü
5 * @returns {Object} Verimlilik, eğim, rSquared ve y-kesişimi içeren nesne
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Log seyreltme değerlerini oluştur
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Doğrusal regresyon için ortalamaları hesapla
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Eğim ve y-kesişimini hesapla
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // R-kareyi hesapla
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Verimliliği hesapla
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Örnek kullanım
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Verimlilik: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Eğim: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kare: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-kesişimi: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60İyi bir qPCR verimliliği genellikle %90 ile %110 (0.9-1.1) arasında olmalıdır. %100 verimlilik, her döngüde PCR ürününün mükemmel iki katına çıktığını temsil eder. Bu aralığın dışındaki verimlilikler, primer tasarımı, reaksiyon koşulları veya inhibitörlerin varlığı ile ilgili sorunları gösterebilir.
%100'den fazla verimlilik, aşağıdaki nedenlerden kaynaklanabilir:
Düşük bir R² değeri (0.98'in altında), standart eğrinizde kötü bir doğrusal ilişkiyi gösterir ve bu, aşağıdaki nedenlerden kaynaklanabilir:
Güvenilir verimlilik hesaplamaları için en az 3 seyreltme noktası gereklidir, ancak daha doğru sonuçlar için 5-6 nokta önerilmektedir. Bu noktalar, deneysel örneklerinizde beklenen şablon konsantrasyonlarının tüm dinamik aralığını kapsamalıdır.
ΔΔCt yöntemi kullanarak göreli nicelendirmede, hedef ve referans genler arasında eşit verimliliklerin (ideal olarak %100) olduğu varsayılır. Verimlilikler önemli ölçüde farklı olduğunda:
Hayır, verimlilik her primer çifti için belirlenmeli ve yeniden doğrulanmalıdır:
PCR inhibitörleri:
Terimler genellikle birbirinin yerine kullanılsa da:
qPCR verimliliğini artırmak için:
Önemli ölçüde farklı verimliliklere sahip örnekleri karşılaştırmak önerilmez çünkü:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, ve diğerleri. MIQE kılavuzları: Nicel gerçek zamanlı PCR deneylerinin yayınlanması için minimum bilgi. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Gerçek zamanlı RT-PCR'de göreli nicelendirme için yeni bir matematiksel model. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. PCR verimliliği tahmininin ne kadar iyi olduğu: Kesin ve sağlam qPCR verimliliği değerlendirmeleri için öneriler. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Nihai qPCR Deney: Yayın Kalitesinde, Tek Seferde Tekrar Edilebilir Veriler Üretmek. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, ve diğerleri. Amplifikasyon verimliliği: nicel PCR verilerinin analizi için temel ve yanlılığı bağlamak. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetik PCR analizi: DNA amplifikasyon reaksiyonlarının gerçek zamanlı izlenmesi. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Gerçek Zamanlı PCR Uygulama Kılavuzu. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Gerçek Zamanlı PCR El Kitabı. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
qPCR Verimliliği Hesaplayıcımız, araştırmacıların nicel PCR deneylerini doğrulamak ve optimize etmek için basit ama güçlü bir araç sunar. Standart eğrilerden verimliliği doğru bir şekilde hesaplayarak, güvenilir nicelendirme sağlayabilir, sorunlu testleri çözebilir ve qPCR deneylerinde en iyi uygulamalara uyabilirsiniz.
Bugün hesaplayıcımızı deneyin ve qPCR verilerinizi iyileştirin!
İş akışınız için faydalı olabilecek daha fazla aracı keşfedin