BCA testi absorbans okumalarına ve istenen protein miktarına dayalı olarak hassas örnek hacimlerini hesaplayın. Batı blotları ve diğer laboratuvar uygulamalarında tutarlı protein yüklemesi için gereklidir.
Bu araç, BCA absorbans sonuçları ve örnek kütlesine dayanarak gerekli örnek hacmini hesaplar. Her örnek için absorbans değerini ve örnek kütlesini girerek karşılık gelen örnek hacmini hesaplayın.
Örnek hacmi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbans Hesaplayıcı, araştırmacıların ve laboratuvar teknisyenlerinin BCA (bisinkoninik asit) analiz sonuçlarına dayanarak deneyler için uygun örnek hacmini doğru bir şekilde belirlemelerine yardımcı olmak için tasarlanmış özel bir araçtır. Bu hesaplayıcı, BCA analizinizden elde ettiğiniz absorbans okumalarını ve istediğiniz örnek kütlesini alarak, batı blotlama, enzimatik analizler ve diğer protein analiz teknikleri gibi uygulamalarda tutarlı protein yüklemesi için gereken kesin hacmi hesaplar.
BCA analizi, biyokimya ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında protein miktarını belirlemek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Protein örneklerinizin absorbansını ölçerek ve bunları bir standart eğri ile karşılaştırarak, yüksek doğrulukla protein konsantrasyonunu belirleyebilirsiniz. Hesaplayıcımız, bu süreci otomatikleştirerek absorbans okumalarını deneyleriniz için gereken tam örnek hacimlerine dönüştürür.
Bisinkoninik Asit (BCA) analizi, bir çözeltideki toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan biyokimyasal bir analizdir. Bu analizin prensibi, alkali koşullar altında bir Cu²⁺-protein kompleksinin oluşumuna dayanır ve ardından Cu²⁺'nin Cu¹⁺'ye indirgenmesi sağlanır. İndirgenme miktarı, mevcut proteinle orantılıdır. BCA, alkali ortamlarda Cu¹⁺ ile mor renkte bir kompleks oluşturur ve bu da proteinlerin indirgenmesini izlemek için bir temel sağlar.
Mor rengin yoğunluğu, protein konsantrasyonu ile orantılı olarak artar ve bu, yaklaşık 562 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilir. Absorbans okumaları daha sonra bilinmeyen örneklerdeki protein konsantrasyonunu belirlemek için bir standart eğri ile karşılaştırılır.
BCA absorbans sonuçlarından örnek hacmini hesaplamak için temel formül şudur:
Burada:
Protein konsantrasyonu, absorbans okumalarından standart eğri denklemi kullanılarak hesaplanır:
Standart bir BCA analizi için tipik eğim yaklaşık 2.0'dır ve kesişim genellikle sıfıra yakındır, ancak bu değerler belirli analiz koşullarınıza ve standart eğrinize bağlı olarak değişebilir.
Hesaplayıcımız, BCA analiz sonuçlarından örnek hacimlerini belirleme sürecini basitleştirir. Doğru hesaplamalar için şu adımları izleyin:
Örnek Bilgilerini Girin:
Standart Eğri Türünü Seçin:
Sonuçları Görüntüleyin:
Sonuçları Kopyala veya Dışa Aktar:
Pratik bir örneği inceleyelim:
Bu, 20 μg protein elde etmek için 13.33 μL örnek yüklemeniz gerektiği anlamına gelir.
Hesaplayıcı, birkaç önemli bilgi parçası sağlar:
Protein Konsantrasyonu: Bu, seçtiğiniz standart eğri kullanılarak absorbans okumalarınızdan hesaplanır. Örneğinizdeki birim hacim başına protein miktarını (μg/μL) temsil eder.
Örnek Hacmi: Bu, istediğiniz protein miktarını içeren örnek hacmidir. Bu değer, deneylerinizi hazırlarken kullanacağınız değerdir.
Uyarılar ve Öneriler: Hesaplayıcı, aşağıdakiler için uyarılar verebilir:
Bu hesaplayıcının en yaygın uygulamalarından biri, batı blotlama için örnek hazırlamaktır. Tutarlı protein yüklemesi, güvenilir batı blot sonuçları için kritik öneme sahiptir ve bu hesaplayıcı, her örnek için protein miktarını yüklemenizi sağlar, hatta konsantrasyonları farklı olsa bile.
Örnek iş akışı:
Enzimatik analizler için, genellikle farklı örnekler veya deneyler arasında reaksiyon koşullarını standartlaştırmak için belirli bir miktarda protein kullanmak gereklidir.
Örnek iş akışı:
İmmünopresipitasyon (IP) deneylerinde, başlangıçta tutarlı bir protein miktarı kullanmak, farklı koşullar arasındaki sonuçları karşılaştırmak için önemlidir.
Örnek iş akışı:
Protein saflaştırma sırasında, farklı adımlardaki protein konsantrasyonunu izlemek ve hesaplamak genellikle gereklidir.
Örnek iş akışı:
Hesaplayıcı, standart BCA analizleri için varsayılan parametreler sağlasa da, kendi standart eğrilerinizi oluşturduysanız özel değerler girebilirsiniz. Bu, özellikle aşağıdaki durumlarda faydalıdır:
Özel bir standart eğri kullanmak için:
Hesaplayıcı, birden fazla örnek eklemenize ve hacimlerini aynı anda hesaplamanıza olanak tanır. Bu, farklı koşullar için tutarlı protein yüklemesi hazırlarken özellikle faydalıdır.
Toplu işlem yapmanın avantajları:
Absorbans okumalarınız 2.0'ın üzerindeyse, BCA analizinin doğrusal aralığının dışında olabilir. Bu durumda:
0.1'in altındaki absorbans okumaları, analizin tespit sınırına yakın olabileceği anlamına gelir, bu da doğruluğu etkileyebilir. Dikkate alın:
Hesaplayıcının çok büyük bir hacim önerdiği durumlarda:
Proteinlerin doğru bir şekilde miktarlandırılması, biyokimya ve moleküler biyoloji alanları ortaya çıktığından beri temel bir gereklilik olmuştur. Erken yöntemler, azot içeriği belirlemeye dayanıyordu ve bu, zaman alıcıydı ve özel ekipman gerektiriyordu.
Kjeldahl Yöntemi (1883): Protein miktarını belirlemek için en eski yöntemlerden biri, azot içeriğini ölçmeye dayanır.
Biuret Testi (1900'lerin Başları): Bu yöntem, peptit bağlarının bakır iyonları ile tepkimesine dayanır ve mor bir renk üretir.
Lowry Analizi (1951): Oliver Lowry tarafından geliştirilen bu yöntem, Biuret tepkimesini Folin-Ciocalteu reaktanı ile birleştirerek duyarlılığı artırmıştır.
Bradford Analizi (1976): Marion Bradford, proteinlere bağlanan ve absorbans maksimumunu kaydıran Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasını kullanarak bu yöntemi geliştirmiştir.
BCA Analizi (1985): Paul Smith ve arkadaşları tarafından Pierce Kimya Şirketi'nde geliştirilen bu yöntem, Biuret tepkimesini BCA tespiti ile birleştirerek daha iyi bir duyarlılık ve deterjanlarla uyumluluk sunmuştur.
BCA analizi, Smith ve arkadaşlarının 1985 yılında "Bicinchoninic Acid ile Protein Miktarının Ölçümü" başlıklı makalede ilk kez tanımlanmıştır. Mevcut yöntemlerin sınırlamalarını gidermek amacıyla geliştirilmiştir, özellikle protein ekstraksiyonu ve saflaştırmasında yaygın olarak kullanılan çeşitli kimyasalların müdahalesine karşı.
Ana yenilik, protein aracılığıyla üretilen Cu¹⁺ iyonlarını tespit etmek için bisinkoninik asidin kullanılmasıdır. Bu, spektrofotometrik olarak ölçülebilen mor renkte bir kompleks oluşturur. Bu, birkaç avantaj sağlamıştır:
Tanıtımından bu yana, BCA analizi, dünya genelinde biyokimya ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan protein miktarlandırma yöntemlerinden biri haline gelmiştir.
1=IF(B2<=0,"Hata: Geçersiz absorbans",IF(C2<=0,"Hata: Geçersiz örnek kütlesi",C2/(2*B2)))
2
3' Burada:
4' B2, absorbans okumalarını içerir
5' C2, μg cinsinden istenen örnek kütlesini içerir
6' Formül, gereken örnek hacmini μL cinsinden döndürür
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Absorbans değerinden protein konsantrasyonunu hesapla."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbans negatif olamaz")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Absorbans ve istenen kütleye göre gereken örnek hacmini hesapla."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Örnek kütlesi pozitif olmalıdır")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Hesaplanan protein konsantrasyonu pozitif olmalıdır")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Örnek kullanım
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorbans {absorbance} ve istenen protein kütlesi {sample_mass} μg için:")
31 print(f"Protein konsantrasyonu: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Gerekli örnek hacmi: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Hata: {e}")
351# Absorbans değerinden protein konsantrasyonunu hesaplamak için fonksiyon
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbans negatif olamaz")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Örnek hacmini hesaplamak için fonksiyon
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Örnek kütlesi pozitif olmalıdır")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Hesaplanan protein konsantrasyonu pozitif olmalıdır")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Örnek kullanım
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorbans %.2f ve istenen protein kütlesi %.2f μg için:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Protein konsantrasyonu: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Gerekli örnek hacmi: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Hata: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbans negatif olamaz");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Örnek kütlesi pozitif olmalıdır");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Hesaplanan protein konsantrasyonu pozitif olmalıdır");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Örnek kullanım
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorbans ${absorbance} ve istenen protein kütlesi ${sampleMass} μg için:`);
33 console.log(`Protein konsantrasyonu: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Gerekli örnek hacmi: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Hata: ${error.message}`);
37}
38Absorbans ve protein konsantrasyonu arasındaki ilişki genellikle belirli bir aralık içinde doğrusaldır. Aşağıda standart bir BCA eğrisinin görselleştirilmesi bulunmaktadır:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Farklı protein miktarlandırma yöntemlerinin çeşitli avantajları ve sınırlamaları vardır. İşte BCA analizinin diğer yaygın yöntemlerle karşılaştırması:
| Yöntem | Duyarlılık Aralığı | Avantajlar | Sınırlamalar | En İyi Kullanım |
|---|---|---|---|---|
| BCA Analizi | 5-2000 μg/mL | • Deterjanlarla uyumlu • Daha az protein-protein varyasyonu • Stabil renk gelişimi | • İndirgeme ajanları tarafından etkilenir • Bazı şelatlayıcı ajanlar tarafından etkilenir | • Genel protein miktarlandırma • Deterjan içeren örnekler |
| Bradford Analizi | 1-1500 μg/mL | • Hızlı (2-5 dk) • Az sayıda müdahale eden madde | • Yüksek protein-protein varyasyonu • Deterjanlarla uyumsuz | • Hızlı ölçümler • Deterjansız örnekler |
| Lowry Yöntemi | 1-1500 μg/mL | • İyi kurulmuş • İyi duyarlılık | • Birçok müdahale eden madde • Birden fazla adım | • Tarihsel tutarlılık • Saf protein örnekleri |
| UV Absorbans (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Yok edici değildir • Çok hızlı • Reaktana ihtiyaç yok | • Nükleik asitlerden etkilenir • Saf örnekler gerektirir | • Saf protein çözeltileri • Saflaştırma sırasında hızlı kontroller |
| Florometrik | 0.1-500 μg/mL | • En yüksek duyarlılık • Geniş dinamik aralık | • Pahalı reaktana ihtiyaç • Florometre gerektirir | • Çok seyreltik örnekler • Sınırlı örnek hacmi |
BCA (bisinkoninik asit) analizi, esas olarak bir örnekteki toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. Batı blotlama, enzimatik analizler, immünopresipitasyon ve protein saflaştırma gibi uygulamalar için biyokimya, hücre biyolojisi ve moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır.
BCA analizi, doğru bir şekilde yapıldığında genellikle %5-10 doğruluk sağlar. Doğruluğu, standart eğrinin kalitesi, müdahale eden maddelerin yokluğu ve bilinmeyen proteinin bileşiminin kullanılan standart proteine benzerliği gibi birkaç faktöre bağlıdır.
BCA analizi sonuçlarını etkileyebilecek birkaç madde bulunmaktadır:
Ana farklar şunlardır:
Hesaplayıcınızın çok büyük bir hacim önerdiği durumlarda, genellikle örneğinizde düşük protein konsantrasyonu olduğunu gösterir. Bu, aşağıdaki nedenlerden kaynaklanabilir:
Örneğinizi konsantre etmeyi veya deney tasarımınızı daha düşük protein konsantrasyonlarını karşılayacak şekilde ayarlamayı düşünün.
Bu hesaplayıcı, özellikle BCA analiz sonuçları için tasarlanmıştır. Temel prensip (konsantrasyonu hacme dönüştürmek) diğer yöntemler için geçerli olsa da, absorbans ve protein konsantrasyonu arasındaki ilişki farklı analizler arasında değişir. Diğer yöntemler için (Bradford veya Lowry gibi) farklı standart eğri parametreleri kullanmanız gerekecektir.
Doğrusal aralığın dışındaki absorbans okumaları (genellikle >2.0) için:
Bovine Serum Albumin (BSA), BCA analizleri için en yaygın kullanılan standarttır çünkü:
Ancak, örneklerinizde BSA'dan önemli ölçüde farklı bir protein baskınsa, daha doğru sonuçlar için o proteini standart olarak kullanmayı düşünün.
BCA reaksiyonunda gelişen mor renk, oda sıcaklığında birkaç saat boyunca stabil kalır ve bu süre içinde ölçülebilir. Ancak en iyi sonuçlar için, tüm standartlar ve örneklerinizi aynı zaman diliminde ölçmeniz önerilir.
Teknik olarak, standart eğrisi yeniden kullanılabilir, ancak doğru miktarlandırma için önerilmez. Reaktandaki değişiklikler, inkübasyon koşulları ve cihaz kalibrasyonu, absorbans ve protein konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi etkileyebilir. Güvenilir sonuçlar için, her seferinde taze bir standart eğri oluşturmanız önerilir.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, ve diğerleri. "Bicinchoninic Acid ile Protein Miktarının Ölçümü." Analitik Biyokimya. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Analiz Kiti." Talimatlar. Erişim adresi: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Bicinchoninic Asit (BCA) Analizi için Protein Miktarlandırma." In: Walker JM, ed. Protein Protokolü El Kitabı. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Protein Konsantrasyonunu Belirleme Yöntemleri." Current Protocols in Protein Science. 2007;Bölüm 3:Ünite 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Protein Miktarlandırma." Enzimolojide Yöntemler. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Artık BCA protein miktarlandırması ve örnek hacmi hesaplama prensiplerini anladığınıza göre, laboratuvar iş akışınızı hızlandırmak için hesaplayıcımızı deneyin. Absorbans okumalarınızı ve istenen örnek kütlenizi girin ve anında doğru örnek hacmi hesaplamaları alın.
Batı blotlama, enzimatik analizler veya herhangi bir protein bazlı deney için örnek hazırlarken, hesaplayıcımız tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmenize yardımcı olacaktır. Zaman kazanın, hataları azaltın ve deneylerinizin tekrarlanabilirliğini artırın BCA Absorbans Örnek Hacmi Hesaplayıcısı ile.
İş akışınız için faydalı olabilecek daha fazla aracı keşfedin