Калькулятор ефективності qPCR: Інструмент аналізу стандартної кривої

Калькулятор ефективності qPCR

Калькулятор ефективності qPCR оцінює, наскільки добре реакція кількісної ПЛР (qPCR) копіює цільову послідовність ДНК під час кожного циклу ампліфікації. Він використовує значення Ct (номер циклу, на якому флуоресцентний сигнал перетинає заданий поріг) із серії розведень для обчислення ефективності, нахилу, точки перетину та R².

Що таке ефективність qPCR?

Кількісна ПЛР відстежує флуоресценцію в міру того, як реакція копіює цільову послідовність ДНК цикл за циклом. Ефективність ампліфікації описує, наскільки збільшується кількість цільової ДНК під час кожного циклу. За ефективності 100% кількість цільової ДНК подвоюється в кожному циклі.

Реальні реакції рідко досягають рівно 100%. Більшість лабораторій вважає прийнятною для надійного кількісного визначення ефективність від 90% до 110%. Значення нижче 90% або вище 110% вказує на проблему, наприклад неналежне конструювання праймерів, інгібітори ПЛР, що залишилися після екстракції зразка, або помилки піпетування під час приготування серії розведень.

Ефективність має найбільше значення під час порівняння експресії генів у різних зразках. Поширений метод ΔΔCt для обчислення кратної зміни передбачає, що кожна реакція відбувається з ефективністю 100%. Якщо виміряна ефективність відрізняється від 100% або якщо цільовий і референтний гени мають різну ефективність, результати кратної зміни можуть бути неточними.

Формула ефективності qPCR

Ефективність обчислюють за нахилом стандартної кривої — прямої, побудованої за значеннями Ct залежно від логарифма за основою 10 (log10) кількості вихідної ДНК у серії розведень.

E = 10^(-1/нахил) - 1

E — ефективність, виражена десятковим дробом (для отримання відсоткового значення потрібно помножити на 100). Нахил — це нахил прямої стандартної кривої. Він від’ємний, оскільки Ct зростає зі зменшенням кількості вихідної ДНК.

Нахил -3,32 відповідає ефективності 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Це пояснюється тим, що 10-кратне розведення має зміщувати Ct приблизно на 3,32 циклу, якщо під час кожного циклу реакції кількість ДНК подвоюється, оскільки log2(10) приблизно дорівнює 3,32.

На практиці прийнятним вважають нахил від -3,1 до -3,6. Цей діапазон відповідає ефективності приблизно від 90% до 110%. Нахил, ближчий до -3,1, дає вищу розраховану ефективність; нахил, ближчий до -3,6, — нижчу.

Як обчислити ефективність qPCR: метод стандартної кривої

1. Підготуйте серію розведень. Почніть із найбільш концентрованого зразка та розводьте його в однакове число разів, зазвичай у 10 разів, для кожного наступного зразка. Проведіть qPCR для кожного розведення та запишіть його значення Ct.
2. Перетворіть кожне розведення на значення log10. Якщо вважати перший, найбільш концентрований зразок позицією 0, то для зразка з номером i log10(відносної кількості) дорівнює -i × log10(коефіцієнта розведення).
3. Побудуйте для кожного розведення графік залежності Ct (вертикальна вісь) від значення log10 (горизонтальна вісь) і виконайте лінійну регресію.
4. Визначте нахил, точку перетину та R² регресійної прямої.
5. Підставте нахил у формулу E = 10^(-1/нахил) - 1, щоб отримати ефективність.

Критерії якості стандартної кривої

• R² не менше ніж 0,98. Цей показник вимірює, наскільки точки відповідають прямій. Нижче значення часто вказує на помилки піпетування або нестабільну ампліфікацію.
• Нахил від -3,1 до -3,6. Цей діапазон відповідає ефективності 90–110%.
• Щонайменше три точки розведення. П’ять або шість точок дають надійнішу пряму й полегшують виявлення викиду.
• Для найбільш концентрованого зразка Ct має бути приблизно 15-20. Для найбільш розведеного зразка Ct має залишатися нижче за Ct 35, оскільки вищі значення наближаються до межі виявлення.

Приклад обчислення

Серія з п’яти розведень, кожне з яких виконано в 10 разів, дає такі значення Ct — від найбільш до найменш концентрованого: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Значення log10(відносної кількості) дорівнюють 0, -1, -2, -3, -4, оскільки кожен етап розведення додає -log10(10), тобто -1. На кожному етапі Ct зростає на 3,5 циклу, тому точки лежать на прямій, а лінійна регресія дає:

• Нахил: -3,5
• Точка перетину: 15,0
• R²: 1,0

Ефективність: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, або приблизно 93%.

Ефективність 93% за R² = 1,0 відповідає стандартним критеріям якості та придатна для кількісного визначення експресії генів.

Приклад коду

Ця функція JavaScript використовує той самий метод, що й калькулятор. Індекс кожного значення Ct береться з протилежним знаком перед обчисленням логарифма, оскільки перший, найбільш концентрований зразок має найбільшу відносну кількість, а кожен наступний зразок є більш розведеним.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Чому ефективність важлива для експресії генів

Обчислення кратної зміни, зокрема методом ΔΔCt, передбачають, що в кожному циклі кількість цільової ДНК подвоюється. Якщо цільовий і референтний гени мають різну виміряну ефективність, звичайна формула ΔΔCt дає похибку. За відмінності ефективності більш ніж приблизно на п’ять відсоткових пунктів дослідники часто переходять до розрахунку з поправкою на ефективність, наприклад до методу, описаного Майклом Пфаффлом у 2001 році. Настанови MIQE — широко цитований набір стандартів звітності для qPCR, опублікований у 2009 році, — рекомендують наводити розраховані ефективність, нахил і R² разом із результатами кількісного визначення.

Поширені запитання

Який відсоток ефективності qPCR є добрим?

Загалом прийнятним вважається діапазон від 90% до 110%, а для добре оптимізованих аналізів — приблизно 95–105%. Нахил -3,32 відповідає рівно 100%.

Чому ефективність моєї qPCR перевищує 110%?

Поширені причини включають помилки піпетування під час приготування серії розведень, димери праймерів, інгібітори, які неоднаково впливають на концентровані та розведені зразки, або поріг флуоресценції, встановлений за межами експоненційної фази ампліфікації. Крива плавлення з більш ніж одним піком може вказувати на димери праймерів.

Чому ефективність моєї qPCR нижча за 90%?

Ймовірні причини включають неналежне конструювання праймерів, інгібітори ПЛР, що залишилися після екстракції зразка, або неоптимальну температуру відпалу. Перевірка специфічності праймерів і проведення температурного градієнта можуть допомогти знайти причину.

Що означає низьке значення R²?

R² показує, наскільки добре значення Ct відповідають прямій залежності від логарифма кількості. Значення нижче 0,98 може свідчити про нестабільне піпетування, інгібований зразок або точку розведення поблизу межі виявлення.

Скільки точок розведення потрібно для стандартної кривої?

Щонайменше три — це мінімум, необхідний для лінійної регресії. П’ять або шість точок дають надійніший нахил і полегшують виявлення викидів.

Чи може ефективність змінюватися між експериментами?

Так. Нова партія реагентів, нова партія праймерів, інший тип зразка або інший прилад для qPCR можуть змінити ефективність. Багато лабораторій повторно перевіряють ефективність кожні кілька місяців або з кожною новою партією реагентів.

Джерела

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA та ін. Настанови MIQE: мінімальна інформація для публікації експериментів із кількісною ПЛР у реальному часі. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Нова математична модель для відносного кількісного визначення методом RT-ПЛР у реальному часі. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Наскільки точним є оцінювання ефективності ПЛР: рекомендації щодо точного й надійного оцінювання ефективності qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.