Розрахуйте ефективність ПЦР за значеннями Ct та факторами розведення. Аналізуйте стандартні криві, визначайте ефективність ампліфікації та перевіряйте свої кількісні експерименти qPCR.
Значення повинно бути позитивним
Значення повинно бути позитивним
Значення повинно бути позитивним
Значення повинно бути позитивним
Значення повинно бути позитивним
Введіть дійсні дані, щоб згенерувати графік
Ефективність qPCR є мірою того, наскільки добре виконується реакція ПЛР. Ефективність 100% означає, що кількість продукту ПЛР подвоюється з кожним циклом під час експоненційної фази.
Ефективність розраховується з нахилу стандартної кривої, яка отримується шляхом побудови значень Ct проти логарифму початкової концентрації шаблону (серія розведень).
Ефективність (E) розраховується за формулою:
E = 10^(-1/slope) - 1
Ефективність кількісної полімеразної ланцюгової реакції (qPCR) є критичним параметром, який безпосередньо впливає на точність і надійність ваших експериментів qPCR. Калькулятор ефективності qPCR допомагає дослідникам визначити, наскільки ефективно їхні реакції ПЛР ампліфікують цільові ДНК послідовності з кожним термічним циклом. Ідеальні реакції qPCR повинні мати ефективність у межах 90-110%, що вказує на те, що кількість продукту ПЛР приблизно подвоюється з кожним циклом під час експоненційної фази.
Погана ампліфікаційна ефективність може призвести до неточної кількісної оцінки, ненадійних результатів і помилкових експериментальних висновків. Обчислюючи та контролюючи свою ефективність qPCR, ви можете оптимізувати умови реакції, перевірити дизайн праймерів і забезпечити якість своїх кількісних даних PCR.
Цей калькулятор використовує метод стандартної кривої, який будує графік порогових циклів (Ct) проти логарифму концентрації шаблону (представленого серійними розведеннями), щоб визначити ефективність вашого аналізу qPCR. Отриманий нахил цієї стандартної кривої потім використовується для обчислення ампліфікаційної ефективності за допомогою простого математичного формули.
Ефективність реакції qPCR обчислюється з нахилу стандартної кривої за допомогою наступної формули:
Де:
Для ідеальної реакції ПЛР з 100% ефективністю (ідеальне подвоєння ампліконів з кожним циклом) нахил буде -3.32. Це тому, що:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (або 100%)}
Відсоток ефективності обчислюється шляхом множення десяткової ефективності на 100:
\text{Ефективність (%)} = E \times 100\%
Стандартна крива створюється шляхом побудови графіка значень Ct (ось y) проти логарифму початкової концентрації шаблону або фактора розведення (ось x). Залежність між цими змінними повинна бути лінійною, а якість цієї лінійної залежності оцінюється за допомогою коефіцієнта детермінації (R²).
Для надійних обчислень ефективності qPCR:
Підготовка даних: Калькулятор приймає ваші значення Ct для кожної точки розведення та фактор розведення як вхідні дані.
Логарифмічна трансформація: Серія розведення трансформується в логарифмічну шкалу (логарифм за основою 10).
Лінійна регресія: Калькулятор виконує аналіз лінійної регресії на логарифмічно трансформованих даних, щоб визначити нахил, y-перехоплення та значення R².
Обчислення ефективності: Використовуючи значення нахилу, ефективність обчислюється за формулою E = 10^(-1/slope) - 1.
Інтерпретація результатів: Калькулятор відображає ефективність у відсотках, разом із нахилом та значенням R², щоб допомогти вам оцінити надійність вашого аналізу qPCR.
Дотримуйтесь цих кроків, щоб обчислити свою ефективність qPCR:
Встановіть кількість розведень: Виберіть, скільки точок розведення у вас є в стандартній кривій (рекомендується від 3 до 7 точок).
Введіть фактор розведення: Введіть фактор розведення, що використовувався між послідовними зразками (наприклад, 10 для 10-кратного розведення, 5 для 5-кратного розведення).
Введіть значення Ct: Введіть значення Ct для кожної точки розведення. Зазвичай перше розведення (Розведення 1) містить найвищу концентрацію шаблону, що призводить до найнижчого значення Ct.
Перегляньте результати: Калькулятор автоматично обчислить і відобразить:
Інтерпретуйте результати: Оцініть, чи ваша ефективність qPCR знаходиться в межах прийнятного діапазону (90-110%) і чи значення R² вказує на надійну стандартну криву (≥ 0.98).
Скопіюйте результати: Використовуйте кнопку "Скопіювати результати", щоб скопіювати всі обчислені значення для ваших записів або публікацій.
Давайте пройдемо через приклад:
Коли побудувати на стандартній кривій:
Калькулятор виконає лінійну регресію та визначить:
Використовуючи формулу ефективності:
Це вказує на хорошу ефективність qPCR у 93%, що знаходиться в межах прийнятного діапазону 90-110%.
Перед використанням нової пари праймерів для кількісних експериментів важливо перевірити їхню продуктивність. Обчислення ефективності qPCR допомагає:
Під час розробки нових аналізів qPCR обчислення ефективності є критично важливими для:
У експериментах з відносною кількісною оцінкою знання ефективності ПЛР є важливими для:
У клінічних і діагностичних умовах ефективність qPCR є важливою для:
Для екологічних і безпекових застосувань у харчуванні обчислення ефективності допомагають:
Хоча метод стандартної кривої є найпоширенішим підходом для обчислення ефективності qPCR, існують альтернативні методи:
Цей метод обчислює ефективність з даних флуоресценції єдиної кривої ампліфікації, без потреби в серії розведень. Програмне забезпечення, таке як LinRegPCR, аналізує експоненційну фазу окремих реакцій, щоб визначити ефективність.
Переваги:
Недоліки:
Цифрова ПЛР (dPCR) забезпечує абсолютну кількісну оцінку без потреби в стандартній кривій або обчисленнях ефективності.
Переваги:
Недоліки:
Деяке програмне забезпечення для аналізу qPCR пропонує методи порівняльної кількісної оцінки, які оцінюють ефективність без повної стандартної кривої.
Переваги:
Недоліки:
Розвиток qPCR і обчислень ефективності значно еволюціонував за останні кілька десятиліть:
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була винайдена Кері Маллісом у 1983 році, що революціонізувало молекулярну біологію. Однак традиційна ПЛР була лише якісною або напівкількісною. Перша система реального часу ПЛР була розроблена на початку 1990-х років Расселом Хігі та його колегами, які продемонстрували, що моніторинг продуктів ПЛР під час їх накопичення (за допомогою флуоресценції етідіум броміду) може надати кількісну інформацію.
З розвитком технології qPCR дослідники визнали важливість стандартизації та валідації. Концепція ефективності ПЛР стала центральною для надійної кількісної оцінки:
Сфера продовжує еволюціонувати з:
Сьогодні обчислення та звітування про ефективність qPCR вважається необхідним для публікації надійних даних qPCR, і такі інструменти, як цей калькулятор, допомагають дослідникам дотримуватись найкращих практик у цій сфері.
1' Excel формула для обчислення ефективності qPCR з нахилу
2' Розмістіть у клітинці B2, якщо нахил у клітинці A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel формула для перетворення ефективності в відсотки
6' Розмістіть у клітинці C2, якщо десяткова ефективність у клітинці B2
7=B2*100
8
9' Функція для обчислення ефективності з значень Ct і фактора розведення
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Обчислення лінійної регресії
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Обчислення нахилу
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Обчислення ефективності
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R функція для обчислення ефективності qPCR з значень Ct і фактора розведення
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Створити логарифмічні значення розведення
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Виконати лінійну регресію
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Витягти нахил і R-квадрат
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Обчислення ефективності
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Повернути результати
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Приклад використання
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Ефективність: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Нахил: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-квадрат: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Обчислити ефективність qPCR з значень Ct і фактора розведення.
8
9 Параметри:
10 ct_values (list): Список значень Ct
11 dilution_factor (float): Фактор розведення між послідовними зразками
12
13 Повертає:
14 dict: Словник, що містить ефективність, нахил, r_squared і y-перехоплення
15 """
16 # Створити логарифмічні значення розведення
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Виконати лінійну регресію
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Обчислення ефективності
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Побудувати стандартну криву з регресійною лінією.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Згенерувати точки для регресійної лінії
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Лог Розведення')
48 plt.ylabel('Значення Ct')
49 plt.title('Стандартна Крива qPCR')
50
51 # Додати рівняння та R² до графіка
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Ефективність = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Приклад використання
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Ефективність: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Нахил: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-квадрат: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-перехоплення: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Побудувати стандартну криву
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Обчислити ефективність qPCR з значень Ct і фактора розведення
3 * @param {Array<number>} ctValues - Масив значень Ct
4 * @param {number} dilutionFactor - Фактор розведення між послідовними зразками
5 * @returns {Object} Об'єкт, що містить ефективність, нахил, rSquared і y-перехоплення
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Створити логарифмічні значення розведення
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Обчислити середні значення для лінійної регресії
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Обчислення нахилу та y-перехоплення
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Обчислення R-квадрат
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Обчислення ефективності
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Приклад використання
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Ефективність: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Нахил: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-квадрат: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-перехоплення: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Добра ефективність qPCR зазвичай знаходиться в межах 90-110% (0.9-1.1). Ефективність 100% представляє ідеальне подвоєння продукту ПЛР з кожним циклом. Ефективності за межами цього діапазону можуть вказувати на проблеми з дизайном праймерів, умовами реакції або наявністю інгібіторів.
Ефективності, що перевищують 100%, можуть виникати через:
Низьке значення R² (нижче 0.98) вказує на погану лінійність вашої стандартної кривої, що може бути викликано:
Для надійних обчислень ефективності рекомендується використовувати не менше 3 точок розведення, але 5-6 точок є оптимальними для більш точних результатів. Ці точки повинні охоплювати весь динамічний діапазон очікуваних концентрацій шаблону у ваших експериментальних зразках.
У відносній кількісній оцінці за допомогою методу ΔΔCt передбачається, що ефективності між цільовими та контрольними генами є рівними (ідеально 100%). Коли ефективності суттєво відрізняються:
Ні, ефективність слід визначати для кожної пари праймерів і повторно перевіряти:
Інгібітори ПЛР можуть:
Ці терміни часто використовуються взаємозамінно, але:
Щоб покращити ефективність qPCR:
Порівняння зразків з суттєво різними ефективностями не рекомендується, оскільки:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Наш калькулятор ефективності qPCR надає простий, але потужний інструмент для дослідників, щоб перевірити та оптимізувати свої експерименти кількісної ПЛР. Точно обчислюючи ефективність за допомогою стандартних кривих, ви можете забезпечити надійну кількісну оцінку, усунути проблеми з аналізами та дотримуватись найкращих практик у проведенні експериментів qPCR.
Спробуйте наш калькулятор сьогодні, щоб покращити якість і надійність ваших даних qPCR!
Відкрийте більше інструментів, які можуть бути корисними для вашого робочого процесу