Розрахуйте концентрацію ДНК за показниками поглинання (A260) з регульованими факторами розведення. Необхідний інструмент для лабораторій молекулярної біології та генетичних досліджень.
Концентрація ДНК розраховується за наступною формулою:
Калькулятор концентрації ДНК - це важливий онлайн інструмент, який допомагає молекулярним біологам, генетикам та лабораторним технікам точно визначити концентрацію ДНК за спектрофотометричними вимірюваннями. Цей безкоштовний калькулятор використовує стандартний метод A260 для перетворення вимірювань УФ-абсорбції в точні значення концентрації ДНК в ng/μL.
Вимірювання концентрації ДНК є основною процедурою в лабораторіях молекулярної біології, що слугує критично важливим етапом контролю якості перед PCR, секвенуванням, клонуванням та іншими молекулярними техніками. Наш калькулятор усуває ручні розрахунки та зменшує помилки при визначенні як концентрації, так і загальної кількості ДНК у ваших зразках.
Розрахунок концентрації ДНК ґрунтується на Законі Бера-Ламберта, який стверджує, що абсорбція розчину прямо пропорційна концентрації абсорбуючих видів у розчині та довжині світлового шляху через розчин. Для дволанцюгової ДНК абсорбція 1.0 при 260 нм (A260) у кюветі з довжиною шляху 1 см відповідає концентрації приблизно 50 ng/μL.
Концентрація ДНК розраховується за наступною формулою:
Де:
Загальна кількість ДНК у зразку може бути розрахована за формулою:
Абсорбція при 260 нм (A260):
Коефіцієнт Перетворення (50):
Фактор Розведення:
Об'єм:
Слідуйте цьому простому процесу, щоб розрахувати концентрацію ДНК з ваших показників A260:
Вимірювання концентрації ДНК є важливим для численних молекулярно-біологічних та дослідницьких застосувань:
Перед лігуванням фрагментів ДНК у вектори знання точної концентрації дозволяє дослідникам розрахувати оптимальне співвідношення вставки до вектора, максимізуючи ефективність трансформації. Наприклад, молярне співвідношення 3:1 вставки до вектора часто дає найкращі результати, що вимагає точних вимірювань концентрації обох компонентів.
PCR-реакції зазвичай вимагають 1-10 ng шаблонної ДНК для оптимального ампліфікації. Занадто мала кількість ДНК може призвести до невдачі ампліфікації, тоді як занадто велика може інгібувати реакцію. Для кількісної PCR (qPCR) навіть більш точна кількість ДНК необхідна для забезпечення точних стандартних кривих та надійної кількісної оцінки.
Протоколи підготовки бібліотеки NGS вказують точні кількості ДНК, часто в діапазоні 1-500 ng в залежності від платформи та застосування. Точне вимірювання концентрації є важливим для успішної підготовки бібліотеки та збалансованого представлення зразків у мультиплексних секвенуваннях.
При введенні ДНК в еукаріотичні клітини оптимальна кількість ДНК варіюється в залежності від типу клітин та методу трансфекції. Зазвичай використовується 0.5-5 μg плазмідної ДНК на лунку в форматі 6-луночного планшета, що вимагає точного вимірювання концентрації для стандартизації експериментів.
У судових застосуваннях зразки ДНК часто обмежені та цінні. Точне кількісне визначення дозволяє судово-біологічним науковцям визначити, чи достатньо ДНК для профілювання, та стандартизувати кількість ДНК, що використовується в подальших аналізах.
Обмежувальні ензими мають специфічні одиниці активності, визначені на μg ДНК. Знання точної концентрації ДНК дозволяє забезпечити правильні співвідношення ензим-ДНК, гарантуючи повне розщеплення без активності "зірки" (неселективного розрізання).
Хоча УФ-спектрофотометрія є найпоширенішим методом для кількісного визначення ДНК, існує кілька альтернатив:
Флуорометричні Методи:
Агарозна Гель-Електрофорез:
Реальний Час PCR:
Цифрова PCR:
Здатність точно вимірювати концентрацію ДНК значно еволюціонувала разом з розвитком молекулярної біології:
Після відкриття структури ДНК Уотсоном і Кріком у 1953 році вчені почали розробляти методи для ізоляції та кількісного визначення ДНК. Ранні підходи спиралися на кольорометричні аналізи, такі як реакція дифенілаламіна, яка виробляла синій колір при реакції з дезоксирибозою в ДНК. Ці методи були відносно нечутливими та схильними до перешкод.
Застосування УФ-спектрофотометрії для кількісного визначення нуклеїнових кислот стало поширеним у 1970-х. Вчені виявили, що ДНК абсорбує УФ-світло з максимумом при 260 нм, і що зв'язок між абсорбцією та концентрацією є лінійним в межах певного діапазону. Коефіцієнт перетворення 50 ng/μL для дволанцюгової ДНК при A260 = 1.0 був встановлений у цей період.
Розробка специфічних флуоресцентних барвників для ДНК у 1980-х і 1990-х роках революціонізувала кількісне визначення ДНК, особливо для розведених зразків. Барвники Хоест та пізніше PicoGreen дозволили виявляти значно чутливіше, ніж це було можливо зі спектрофотометрією. Ці методи стали особливо важливими з появою PCR, яка часто вимагала точного кількісного визначення мінімальних кількостей ДНК.
Введення мікровольтових спектрофотометром, таких як NanoDrop, на початку 2000-х років трансформувало рутинне кількісне визначення ДНК, вимагаючи лише 0.5-2 μL зразка. Ця технологія усунула необхідність у розведеннях та кюветах, роблячи процес швидшим і зручнішим.
Сьогодні передові техніки, такі як цифрова PCR та секвенування наступного покоління, ще більше розширили межі кількісного визначення ДНК, дозволяючи абсолютне кількісне визначення специфічних послідовностей та виявлення одиночних молекул. Проте основний спектрофотометричний принцип, встановлений десятиліття тому, залишається основою рутинного вимірювання концентрації ДНК у лабораторіях по всьому світу.
Давайте розглянемо кілька практичних прикладів розрахунків концентрації ДНК:
Дослідник очистив плазміду та отримав наступні вимірювання:
Розрахунок:
Після витягування геномної ДНК з крові:
Розрахунок:
Відкрийте більше інструментів, які можуть бути корисними для вашого робочого процесу