Калькулятор концентрації ДНК

Калькулятор концентрації ДНК перетворює показник поглинання УФ-випромінювання на 260 нанометрах, який називають A260, на концентрацію ДНК у нанограмах на мікролітр (нг/мкл). Він також показує загальну кількість ДНК у зразку в мікрограмах (мкг).

Що таке поглинання A260?

A260 — це кількість ультрафіолетового світла, яку розчин поглинає на довжині хвилі 260 нанометрів. ДНК найсильніше поглинає УФ-світло поблизу цієї довжини хвилі через свої азотисті основи. Спектрофотометр вимірює A260 після вимірювання холостої проби, під час якого для видалення фонового поглинання використовують той самий буфер, що й для зразка. Чим більше ДНК у розчині, тим вищий показник A260.

Формула концентрації ДНК

Дволанцюгова ДНК поглинає УФ-світло пропорційно до своєї концентрації; цей зв’язок відомий як закон Бера—Ламберта. За стандартної довжини оптичного шляху 1 сантиметр розчин із показником A260 1,0 містить приблизно 50 нг/мкл дволанцюгової ДНК. Це число, коефіцієнт перерахунку, дає змогу перетворити будь-який показник A260 на концентрацію:

Концентрація ДНК (нг/мкл) = A260 × 50 × коефіцієнт розведення

Коефіцієнт розведення враховує будь-яке розведення, виконане перед вимірюванням зразка. Для зразка, виміряного без розведення, коефіцієнт розведення дорівнює 1.

Як розрахувати загальний вихід ДНК

Після визначення концентрації загальну масу ДНК у зразку можна обчислити за його об’ємом:

Загальна кількість ДНК (мкг) = концентрація (нг/мкл) × об’єм (мкл) ÷ 1000

Як розрахувати концентрацію ДНК: покрокова інструкція

Перед вимірюванням ретельно перемішайте зразок. ДНК може прилипати до стінок пробірки або нерівномірно осідати.
Якщо зразок має високу концентрацію, розведіть його, прагнучи отримати показник A260 між 0,1 і 1,0. Поза цим діапазоном показники спектрофотометра найменш надійні.
Відкоригуйте нуль спектрофотометра за холостою пробою з тим самим буфером, який використовували для розведення, а потім виміряйте зразок на 260 нм.
Введіть у калькулятор показник A260, об’єм зразка та коефіцієнт розведення, щоб отримати концентрацію й загальний вихід. Для відображення результату потрібно заповнити всі три поля, а об’єм має бути більшим за нуль.

Приклад обчислення

Приклад 1: нерозведений зразок

Показник A260 дорівнює 0,5, розведення не проводили (коефіцієнт розведення 1), об’єм зразка становить 100 мкл.

Концентрація = 0,5 × 50 × 1 = 25 нг/мкл
Загальна кількість ДНК = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 мкг

Приклад 2: розведений зразок

У пробірці міститься 50 мкл очищеної ДНК. Невелику її частину розвели у 10 разів, і в розведеній частині отримали показник A260 0,75. Коефіцієнт розведення перетворює цей показник назад на концентрацію в початковій пробірці, а 50 мкл — це об’єм, який вводять для розрахунку загального виходу.

Концентрація = 0,75 × 50 × 10 = 375 нг/мкл
Загальна кількість ДНК = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 мкг

Розрахунок коефіцієнта розведення

Коефіцієнт розведення = загальний об’єм після розведення ÷ об’єм початкового зразка.

Додавання 5 мкл розчину ДНК до 45 мкл буфера дає загальний об’єм 50 мкл, тому коефіцієнт розведення дорівнює 50 ÷ 5 = 10. Для нерозведеного зразка коефіцієнт розведення дорівнює 1.

Типові діапазони концентрації ДНК

Концентрація залежить від типу зразка та методу екстракції. Під час виділення геномної ДНК концентрація зазвичай становить приблизно від 10 до 100 нг/мкл. Під час отримання плазмідної ДНК часто спостерігаються вищі концентрації — іноді кілька сотень нг/мкл. Результат, що значно виходить за очікуваний для певного методу діапазон, може вказувати на проблему з екстракцією або самим вимірюванням.

Обмеження вимірювання поглинання УФ-випромінювання

Вимірювання A260 є швидким, але це не найчутливіший і не найспецифічніший метод визначення ДНК. Білки, РНК і деякі компоненти буфера також поглинають світло поблизу 260 нм і можуть завищувати показник. Для перевірки забруднення білками дослідники часто оцінюють співвідношення A260/A280 разом із концентрацією; співвідношення, близьке до 1,8, зазвичай вказує на чистий зразок ДНК. Методи на основі флуоресцентних барвників, як-от аналізи Qubit, зв’язуються лише з дволанцюговою ДНК і дають точніші результати для розбавлених або нечистих зразків, хоча потребують додаткових реагентів і флуорометра.

Поширені запитання

Як розрахувати концентрацію ДНК за показником A260?

Помножте показник A260 на 50 — стандартний коефіцієнт перерахунку для дволанцюгової ДНК, — а потім помножте результат на коефіцієнт розведення. Якщо зразок не розводили, використовуйте коефіцієнт розведення 1.

Яке співвідношення A260/A280 вважається добрим?

Співвідношення, близьке до 1,8, зазвичай вказує на чистий зразок ДНК. Нижче співвідношення свідчить про забруднення білками. Співвідношення вище 2,0 може вказувати на забруднення РНК.

Чи можна використовувати цей калькулятор для РНК?

Не безпосередньо, оскільки для РНК використовується коефіцієнт перерахунку 40 нг/мкл замість 50. Щоб оцінити концентрацію РНК, помножте результат калькулятора на 0,8 (40 ÷ 50) або безпосередньо використайте формулу A260 × 40 × коефіцієнт розведення.

Чому показник A260 має бути між 0,1 і 1,0?

Поглинання залишається приблизно пропорційним концентрації, як описано законом Бера—Ламберта, переважно в межах цього діапазону. Поза ним показники стають менш надійними, тому надто концентрований або надто розбавлений зразок перед повторним вимірюванням потрібно розвести або сконцентрувати.

У чому різниця між концентрацією та чистотою?

Концентрація показує, скільки ДНК міститься у зразку, у нг/мкл. Чистота показує, наскільки зразок вільний від домішок; її оцінюють переважно за співвідношеннями поглинання, такими як A260/A280. Зразок може мати високу концентрацію і водночас бути нечистим або мати низьку концентрацію й бути дуже чистим.

Як перерахувати нг/мкл у мкг/мл?

Ці дві одиниці чисельно рівні. 1 нг/мкл дорівнює 1 мкг/мл, оскільки одиниця маси й одиниця об’єму кожна змінюються в 1000 разів.

Джерела

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-є вид.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Кількісне визначення ДНК і РНК за допомогою абсорбційної та флуоресцентної спектроскопії. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Значення співвідношень A260/A280 для визначення чистоти нуклеїнових кислот. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Калькулятор концентрації ДНК | Перетворювач A260 в нг/мкл