ДНК Лігаційний Калькулятор - Розрахунок Співвідношення Вставки до Вектора для Молекулярного Клонування

Лігування ДНК — це етап молекулярного клонування, на якому фрагмент-вставку приєднують до плазмідного вектора за допомогою ферменту ДНК-лігази T4. Калькулятор лігування ДНК визначає, скільки мікролітрів ДНК-вставки та ДНК-вектора потрібно змішати, щоб реакція досягла заданого молярного співвідношення вставки до вектора.

Що робить калькулятор

Калькулятор використовує шість вхідних параметрів: концентрацію вектора, довжину вектора, концентрацію вставки, довжину вставки, цільове молярне співвідношення вставки до вектора та загальний об’єм реакції. Він також дає змогу задати кількість ДНК-вектора, яку потрібно використати; за замовчуванням це 50 нанограмів (нг). На основі цих значень він обчислює об’єм вектора для піпетування, об’єм вставки для піпетування та кількість буфера або води, яку потрібно додати для досягнення загального об’єму реакції.

Концентрацію вимірюють у нанограмах на мікролітр (нг/мкл), зазвичай за допомогою приладу Nanodrop або Qubit. Довжину вимірюють у парах основ (п.о.). Один кілобаз дорівнює 1000 парам основ. Молярне співвідношення показує, скільки молекул вставки має припадати на одну молекулу вектора. Це не співвідношення мас.

Чому використовують молярне співвідношення, а не співвідношення мас

Однакові маси ДНК не містять однакової кількості молекул. Коротка вставка важить менше, ніж довгий вектор за однакової кількості молекул. Змішування однакових кількостей короткої вставки та довгого вектора в нанограмах призвело б до значно меншої кількості молекул вставки порівняно з кількістю молекул вектора. Калькулятор масштабує масу вставки відповідно до співвідношення довжин фрагментів, щоб кінцева суміш містила потрібну кількість молекул вставки на одну молекулу вектора.

Формула лігування ДНК

Потрібна кількість ДНК-вставки в нанограмах:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

де $m_i$ — кількість вставки в нанограмах, $m_v$ — кількість вектора в нанограмах, $k_i$ — довжина вставки в кілобазах, $k_v$ — довжина вектора в кілобазах, а R — цільове молярне співвідношення вставки до вектора.

Після визначення цієї кількості калькулятор перетворює кількість кожного компонента на об’єм, який можна набрати піпеткою:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

де $V_v$ і $V_i$ — об’єми вектора та вставки в мікролітрах, $c_v$ і $c_i$ — концентрації вектора та вставки в нанограмах на мікролітр, $V_b$ — об’єм буфера, а $V_t$ — загальний об’єм реакції.

Якщо об’єми вектора та вставки разом перевищують загальний об’єм реакції, для буфера, лігази або води не залишається місця. У такому разі калькулятор повідомляє, що загальний об’єм надто малий, замість того щоб показувати від’ємний об’єм буфера.

Приклад обчислення

Дослідник клонуює генний фрагмент розміром 1 кб у плазмідний вектор розміром 3 кб. Планується використати 50 нг ДНК-вектора за молярного співвідношення вставка:вектор 3:1 у реакції об’ємом 20 мкл.

Вхідні дані:

• Концентрація вектора: 50 нг/мкл
• Довжина вектора: 3000 п.о. (3 кб)
• Концентрація вставки: 25 нг/мкл
• Довжина вставки: 1000 п.о. (1 кб)
• Молярне співвідношення: 3
• Загальний об’єм: 20 мкл
• Кількість вектора: 50 нг

Крок 1: кількість вставки

нг вставки = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 нг

Крок 2: об’єми

Об’єм вектора = 50 нг ÷ 50 нг/мкл = 1 мкл

Об’єм вставки = 50 нг ÷ 25 нг/мкл = 2 мкл

Об’єм буфера = 20 − 1 − 2 = 17 мкл

Реакція складається з 1 мкл вектора, 2 мкл вставки та 17 мкл буфера або води; саме сюди також додають лігазу та її реакційний буфер. Ця суміш містить три молекули вставки на кожну молекулу вектора.

Типові молярні співвідношення для лігування

У більшості стандартних реакцій клонування з липкими, виступаючими кінцями використовують співвідношення вставка:вектор 3:1. Лігування фрагментів із тупими кінцями менш ефективне, тому поширеним є підвищене співвідношення, наприклад 5:1. Для дуже великих вставок іноді краще працює знижене співвідношення, ближче до 1:1, оскільки великі фрагменти вже містять багато пар основ на одну молекулу.

Поширені запитання

Що таке лігування ДНК?

Лігування ДНК — це об’єднання двох фрагментів ДНК, зазвичай плазмідного вектора та вставки, в одну безперервну молекулу. Фермент ДНК-лігаза T4 з’єднує кінці фрагментів.

Що означає молярне співвідношення вставка:вектор?

Це кількість молекул ДНК-вставки на одну молекулу вектора в реакції. Співвідношення 3:1 означає три молекули вставки на кожну молекулу вектора, незалежно від співвідношення їхніх мас.

Чому не використовують однакову кількість вектора та вставки в нанограмах?

Фрагменти ДНК різної довжини мають різну масу на молекулу. Вставка розміром 1 кб важить приблизно втричі менше, ніж вектор розміром 3 кб, якщо порівнювати окремі молекули. Однакові кількості кожного фрагмента в нанограмах не дадуть однакової кількості молекул, тому калькулятор коригує масу вставки відповідно до цільового молярного співвідношення.

Що означає надто малий загальний об’єм?

Це означає, що самі об’єми вектора та вставки вже заповнюють увесь об’єм реакції, не залишаючи місця для буфера або лігази. Потрібно збільшити загальний об’єм реакції або використати більш концентровані вихідні розчини ДНК.

Чи можна використовувати цей калькулятор для клонування методом Gibson Assembly або Golden Gate?

Ні. У цих методах застосовують іншу хімію реакції й зазвичай використовують еквімолярні кількості всіх фрагментів, а не фіксоване співвідношення вставка:вектор. Розрахунок об’ємів для них відрізняється від стандартного клонування за допомогою лігази T4.

Яку кількість ДНК-вектора зазвичай використовують?

50 нг — поширена початкова кількість для стандартної реакції лігування. У лабораторіях також використовують від 25 до 100 нг, коригуючи кількість відповідно до концентрації ДНК і масштабу реакції.