Калькулятор лігування ДНК

Вступ

Лігування ДНК — це критична молекулярно-біологічна техніка, що використовується для з'єднання фрагментів ДНК разом з ковалентними зв'язками. Калькулятор лігування ДНК є необхідним інструментом для дослідників, що допомагає визначити оптимальні кількості векторної та вставної ДНК, необхідні для успішних реакцій лігування. Визначаючи правильні мольні співвідношення між вектором (плазмідою) та вставними фрагментами ДНК, цей калькулятор забезпечує ефективні експерименти з молекулярного клонування, мінімізуючи витрати реагентів і невдалі реакції.

Реакції лігування є основоположними для генетичного інженерії, синтетичної біології та процедур молекулярного клонування. Вони дозволяють вченим створювати рекомбінантні молекули ДНК, вставляючи гени інтересу в плазмідні вектори для подальшої трансформації в організми-господарі. Успіх цих реакцій значно залежить від використання відповідних кількостей компонентів ДНК, що саме цей калькулятор допомагає визначити.

Чи ви конструюєте вектори експресії, створюєте бібліотеки генів або виконуєте рутинне субклонування, цей калькулятор лігування ДНК допоможе вам оптимізувати ваші експериментальні умови та підвищити ймовірність успіху. Введіть кілька ключових параметрів про ваші зразки ДНК, і ви швидко отримаєте точні обсяги, необхідні для вашої конкретної реакції лігування.

Формула/Розрахунок

Калькулятор лігування ДНК використовує основну формулу молекулярної біології, яка враховує різні розміри та концентрації з'єднуваних фрагментів ДНК. Основний розрахунок визначає, скільки вставної ДНК потрібно відносно векторної ДНК на основі їх відповідних довжин та бажаного мольного співвідношення.

Розрахунок кількості вставки

Кількість вставної ДНК, що потрібна (в нанограмах), розраховується за наступною формулою:

$\text{ng вставки} = \text{ng вектора} \times \frac{\text{kb розмір вставки}}{\text{kb розмір вектора}} \times \text{мольне співвідношення}$

Де:

• ng вектора = кількість векторної ДНК, що використовується в реакції (зазвичай 50-100 ng)
• kb розмір вставки = довжина вставного фрагмента ДНК в кілобазах (kb)
• kb розмір вектора = довжина векторної ДНК в кілобазах (kb)
• мольне співвідношення = бажане співвідношення молекул вставки до молекул вектора (зазвичай 3:1 до 5:1)

Розрахунки обсягу

Після визначення необхідної кількості вставної ДНК розраховуються потрібні обсяги для реакції:

$\text{Об'єм вектора (μL)} = \frac{\text{ng вектора}}{\text{концентрація вектора (ng/μL)}}$

$\text{Об'єм вставки (μL)} = \frac{\text{ng вставки}}{\text{концентрація вставки (ng/μL)}}$

$\text{Об'єм буфера/води (μL)} = \text{Загальний об'єм реакції (μL)} - \text{Об'єм вектора (μL)} - \text{Об'єм вставки (μL)}$

Приклад розрахунку

Давайте пройдемо через практичний приклад:

• Концентрація вектора: 50 ng/μL
• Довжина вектора: 3000 bp (3 kb)
• Концентрація вставки: 25 ng/μL
• Довжина вставки: 1000 bp (1 kb)
• Бажане мольне співвідношення (вставка:вектор): 3:1
• Загальний об'єм реакції: 20 μL
• Кількість вектора, що використовується: 50 ng

Крок 1: Розрахуйте необхідну кількість вставки $\text{ng вставки} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Крок 2: Розрахуйте обсяги $\text{Об'єм вектора} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Об'єм вставки} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Об'єм буфера/води} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Цей розрахунок забезпечує, що в реакції буде три молекули вставки на кожну молекулу вектора, оптимізуючи шанси на успішне лігування.

Покрокове керівництво щодо використання калькулятора

Наш калькулятор лігування ДНК розроблений, щоб бути інтуїтивно зрозумілим і простим. Дотримуйтесь цих кроків, щоб розрахувати оптимальні обсяги для вашої реакції лігування:

1. Введіть інформацію про вектор:

   • Введіть концентрацію вашого вектора в ng/μL
   • Введіть довжину вектора в основних парах (bp)
   • Вкажіть кількість векторної ДНК, яку ви хочете використовувати в реакції (ng)

2. Введіть інформацію про вставку:

   • Введіть концентрацію вашої вставки в ng/μL
   • Введіть довжину вставки в основних парах (bp)

3. Встановіть параметри реакції:

   • Вкажіть бажане мольне співвідношення (вставка:вектор) - зазвичай між 3:1 і 5:1
   • Введіть загальний об'єм реакції в μL (зазвичай 10-20 μL)

4. Перегляньте результати:

   • Калькулятор автоматично відобразить:
     • Необхідний об'єм вектора (μL)
     • Необхідний об'єм вставки (μL)
     • Об'єм буфера/води, який потрібно додати (μL)
     • Загальний об'єм реакції (μL)
     • Кількість вектора та вставної ДНК у реакції (ng)

5. Скопіюйте результати (за бажанням):

   • Використовуйте кнопку "Скопіювати результати", щоб скопіювати всі розрахунки у ваш буфер обміну для вашого лабораторного зошита або протоколів

Калькулятор виконує перевірки валідації, щоб забезпечити, що всі введення є позитивними числами і що загальний об'єм є достатнім для необхідних обсягів ДНК. Якщо виявлено будь-які помилки, корисні повідомлення про помилки допоможуть вам виправити введення.

Сфери використання

Калькулятор лігування ДНК є цінним у численних застосуваннях молекулярної біології:

Молекулярне клонування

Найбільш поширеним випадком використання є стандартне молекулярне клонування, де дослідники вставляють гени або фрагменти ДНК у плазмідні вектори. Калькулятор забезпечує оптимальні умови для:

• Субклонування генів між різними векторами експресії
• Створення білкових фузій шляхом з'єднання кількох генних фрагментів
• Конструювання репортерних генних тестів
• Побудови бібліотек плазмід

Синтетична біологія

У синтетичній біології, де часто збираються кілька фрагментів ДНК:

• Реакції Gibson Assembly виграють від точних співвідношень вставки:вектора
• Системи Golden Gate вимагають специфічних концентрацій ДНК
• BioBrick збірка стандартизованих генетичних частин
• Конструювання синтетичних генетичних схем

Розробка діагностичних наборів

При розробці молекулярних діагностичних інструментів:

• Клонування генетичних маркерів, специфічних для захворювання
• Конструювання позитивних контрольних плазмід
• Розробка калібрувальних стандартів для qPCR

Системи експресії білків

Для дослідників, які працюють над виробництвом білків:

• Оптимізація співвідношень вставки:вектора для векторів високої копії
• Конструювання індукованих систем експресії
• Створення секреційних векторів для очищення білків

Застосування CRISPR-Cas9

У додатках редагування геному:

• Клонування направляючих РНК у CRISPR-вектори
• Створення донорських шаблонів для гомологічно-орієнтованого ремонту
• Побудова бібліотек направляючих РНК для скринінгу

Складні лігації

Калькулятор особливо цінний для складних сценаріїв лігування:

• Клонування великих вставок (>5 kb)
• Дуже малих вставок (<100 bp)
• Лігування з тупими кінцями, які мають нижчу ефективність
• Реакції збору з кількох фрагментів

Альтернативи

Хоча наш калькулятор лігування ДНК забезпечує точні розрахунки для традиційних реакцій лігування, існує кілька альтернативних підходів для з'єднання фрагментів ДНК:

1. Gibson Assembly: Використовує екзонуклеазу, полімеразу та лігазу в одній реакції, щоб з'єднати перекриваючі фрагменти ДНК. Ніякі традиційні розрахунки лігування не потрібні, але співвідношення концентрацій все ще важливі.

2. Golden Gate Assembly: Використовує ферменти обмеження типу IIS для напрямного, безшовного з'єднання кількох фрагментів. Вимагає еквімолярних кількостей усіх фрагментів.

3. SLIC (Клонування незалежне від лігування): Використовує екзонуклеазу для створення однониткових виступів, які з'єднуються разом. Зазвичай використовує еквімолярні співвідношення фрагментів.

4. In-Fusion Cloning: Комерційна система, яка дозволяє з'єднувати фрагменти з 15 bp перекриттями. Використовує специфічне співвідношення на основі розмірів фрагментів.

5. Gateway Cloning: Використовує специфічну рекомбінацію замість лігування. Вимагає специфічних векторів входу та призначення.

6. Емпіричне тестування: Деякі лабораторії віддають перевагу налаштуванню кількох реакцій лігування з різними співвідношеннями вставки:вектора (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) і визначення, що працює найкраще для їх специфічних конструкцій.

7. Програмні калькулятори: Комерційні пакети програмного забезпечення, такі як Vector NTI та SnapGene, включають калькулятори лігування з додатковими функціями, такими як аналіз сайтів обмеження.

Історія

Розробка розрахунків лігування ДНК паралельна еволюції технік молекулярного клонування, які революціонізували молекулярну біологію та біотехнології.

Ранні розробки (1970-ті)

Концепція лігування ДНК для молекулярного клонування виникла в early 1970-х роках з піонерською роботою Пола Берга, Герберта Бойера та Стенлі Коена, які розробили перші рекомбінантні молекули ДНК. У цей період реакції лігування були переважно емпіричними, і дослідники використовували метод проб і помилок для визначення оптимальних умов.

Відкриття ферментів обмеження та ДНК-лігази надало основні інструменти для розрізання та повторного з'єднання молекул ДНК. Т4 ДНК-лігаза, виділена з інфікованих бактеріофагом Т4 Е. coli, стала стандартним ферментом для з'єднання фрагментів ДНК завдяки своїй здатності лігувати як тупі, так і когезивні кінці.

Період вдосконалення (1980-ті-1990-ті)

Оскільки молекулярне клонування стало більш рутинним, дослідники почали розробляти більш систематичні підходи до реакцій лігування. Важливість мольних співвідношень між вектором та вставною ДНК стала очевидною, що призвело до розробки базової формули, яка все ще використовується сьогодні.

Протягом цього періоду дослідники встановили, що надмірна кількість вставної ДНК (зазвичай 3:1 до 5:1 мольного співвідношення вставки до вектора) зазвичай підвищує ефективність лігування для стандартних застосувань клонування. Ці знання спочатку поширювалися через лабораторні протоколи і поступово потрапили в посібники та підручники з молекулярної біології.

Сучасна ера (2000-і-досі)

Поява комп'ютерних інструментів та онлайн-калькуляторів у 2000-х роках зробила точні розрахунки лігування більш доступними для дослідників. Оскільки техніки молекулярної біології стали більш складними, потреба в точних розрахунках стала більш критичною, особливо для складних проектів клонування, що включають кілька фрагментів або великі вставки.

Сьогодні розрахунки лігування ДНК є невід'ємною частиною робочих процесів молекулярного клонування, а спеціалізовані калькулятори, такі як цей, допомагають дослідникам оптимізувати свої експерименти. Основна формула залишилася в основному незмінною, хоча наше розуміння факторів, що впливають на ефективність лігування, покращилося.

Поява альтернативних методів клонування, таких як Gibson Assembly та Golden Gate клонування, ввела нові потреби в розрахунках, але основна концепція мольних співвідношень між фрагментами ДНК залишається важливою для всіх цих технік.

Приклади коду

Ось реалізації калькулятора лігування ДНК на різних мовах програмування:

1' Excel VBA Function for DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculate required insert amount in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculate vector volume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculate insert volume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculate buffer/water volume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Usage example in a cell:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calculate volumes for a DNA ligation reaction.
5    
6    Parameters:
7    vector_concentration (float): Concentration of vector DNA in ng/μL
8    vector_length (float): Length of vector DNA in base pairs
9    insert_concentration (float): Concentration of insert DNA in ng/μL
10    insert_length (float): Length of insert DNA in base pairs
11    molar_ratio (float): Desired molar ratio of insert:vector
12    total_volume (float): Total reaction volume in μL
13    vector_amount (float): Amount of vector DNA to use in ng (default: 50)
14    
15    Returns:
16    dict: Dictionary containing calculated volumes and amounts
17    """
18    # Calculate vector volume
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calculate required insert amount
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calculate insert volume
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calculate buffer/water volume
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Example usage
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convert lengths to kb for calculation
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calculate required insert amount
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calculate volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Example usage
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convert lengths to kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calculate required insert amount
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calculate volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Round to 2 decimal places
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convert lengths to kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calculate required insert amount
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calculate volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Round to 2 decimal places
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Часто задавані питання (FAQ)

Яке оптимальне мольне співвідношення для лігування ДНК?

Оптимальне мольне співвідношення вставки до вектора зазвичай коливається від 3:1 до 5:1 для стандартних застосувань лігування. Однак це може варіюватися в залежності від конкретного сценарію лігування:

• Для лігувань з когезивними кінцями: 1:1 до 3:1
• Для лігувань з тупими кінцями: 3:1 до 5:1
• Для великих вставок (>10 kb): 1:1 до 2:1
• Для малих вставок (<500 bp): 5:1 до 10:1
• Для збору кількох фрагментів: 3:1 для кожної вставки до вектора

Чому моя реакція лігування зазнає невдачі, незважаючи на те, що я використовую розраховані обсяги?

Кілька факторів можуть вплинути на ефективність лігування, окрім мольного співвідношення:

1. Якість ДНК: переконайтеся, що як вектор, так і вставка мають чисті кінці без пошкоджень
2. Дефосфорилювання: перевірте, чи ваш вектор був дефосфорилований, що запобігає самостійному лігуванню
3. Активність ферменту: перевірте, чи ваш лігаза активна і використовується при правильній температурі
4. Час інкубації: деякі лігування виграють від тривалої інкубації (на ніч при 16°C)
5. Умови буфера: переконайтеся, що використовується правильний буфер з АТФ
6. Забруднювачі: очищайте ДНК, щоб видалити інгібітори, такі як ЕДТА або високий вміст солі

Скільки ДНК вектора мені слід використовувати в реакції лігування?

Зазвичай рекомендується використовувати 50-100 ng векторної ДНК для стандартних реакцій лігування. Використання занадто великої кількості вектора може призвести до підвищення фону незрізаного або самостійноз'єднаного вектора, тоді як занадто мало може зменшити ефективність трансформації. Для складних лігувань вам, можливо, потрібно буде оптимізувати цю кількість.

Чи потрібно мені коригувати розрахунки для лігувань з тупими кінцями порівняно з когезивними?

Так. Лігування з тупими кінцями зазвичай менш ефективні, ніж лігування з когезивними (липкими) кінцями. Для лігувань з тупими кінцями використовуйте:

• Вищі мольні співвідношення (3:1 до 5:1 або навіть вище)
• Більше Т4 ДНК-лігази (зазвичай в 2-3 рази більше)
• Довші часи інкубації
• Розгляньте можливість додавання ПЕГ для підвищення ефективності лігування

Як я можу розрахувати лігування для кількох вставок?

Для збору кількох фрагментів:

1. Розрахуйте кожну кількість вставки окремо, використовуючи ту ж формулу
2. Підтримуйте те ж загальне мольне співвідношення (наприклад, для двох вставок використовуйте 1.5:1.5:1 вставка1:вставка2:вектор)
3. Налаштуйте загальний об'єм реакції, щоб врахувати всі фрагменти ДНК
4. Розгляньте можливість послідовного лігування або використання методів збору, таких як Gibson Assembly для кількох фрагментів

Чи можу я використовувати цей калькулятор для Gibson Assembly або Golden Gate Assembly?

Цей калькулятор спеціально розроблений для традиційного лігування з використанням ферментів обмеження та лігази. Для Gibson Assembly зазвичай рекомендуються еквімолярні кількості всіх фрагментів (співвідношення 1:1), хоча базовий розрахунок кількості ДНК на основі довжини є подібним. Для Golden Gate Assembly також зазвичай використовуються еквімолярні співвідношення всіх компонентів.

Як мені врахувати дефосфорилювання вектора в моїх розрахунках?

Дефосфорилювання вектора (видалення 5' фосфатних груп) запобігає самостійному лігуванню, але не змінює розрахунки кількості. Однак для дефосфорилованих векторів:

1. Використовуйте свіжу вставну ДНК з незайманими 5' фосфатами
2. Розгляньте можливість використання трохи вищих співвідношень вставки:вектора (4:1 до 6:1)
3. Переконайтеся, що час лігування довший (принаймні 1 година при кімнатній температурі або на ніч при 16°C)

Який мінімальний загальний об'єм реакції я повинен використовувати?

Мінімальний практичний об'єм реакції зазвичай становить 10 μL, що дозволяє забезпечити адекватне змішування та запобігти проблемам з випаровуванням. Якщо ваші розраховані обсяги ДНК перевищують бажаний об'єм реакції, у вас є кілька варіантів:

1. Використовуйте більш концентровані зразки ДНК
2. Зменшіть кількість вектора (наприклад, 25 ng замість 50 ng)
3. Збільшіть загальний об'єм реакції
4. Розгляньте можливість концентрації ваших зразків ДНК

Скільки часу мені слід інкубувати мою реакцію лігування?

Оптимальні часи інкубації варіюються в залежності від типу лігування:

• Лігування з когезивними кінцями: 1 година при кімнатній температурі (22-25°C) або 4-16 годин при 16°C
• Лігування з тупими кінцями: 2-4 години при кімнатній температурі або на ніч (12-16 годин) при 16°C
• Швидкі лігування (з використанням лігази високої концентрації): 5-15 хвилин при кімнатній температурі

Чи можу я повторно використовувати залишок реакції лігування для трансформації?

Так, суміші лігування зазвичай можуть зберігатися при -20°C і повторно використовуватися для трансформації. Однак кожен цикл заморожування-розморожування може зменшити ефективність. Для найкращих результатів:

1. Аліquot суміш лігування перед заморожуванням
2. Терміново інактивуйте лігази (65°C протягом 10 хвилин) перед зберіганням
3. Використовуйте протягом 1-2 місяців для оптимальних результатів

Посилання

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/