Máy Tính Nồng Độ Protein | A280 sang mg/mL

Máy tính nồng độ protein

Máy tính nồng độ protein chuyển đổi số đo độ hấp thụ ánh sáng từ máy quang phổ thành lượng protein hòa tan trong dung dịch. Kết quả thường được biểu thị bằng miligam trên mililit (mg/mL) hoặc microgam trên mililit (μg/mL). Phép tính dựa trên định luật Beer–Lambert, một mối quan hệ trong hóa học liên kết mức độ hấp thụ ánh sáng của mẫu với lượng chất mà mẫu chứa.

Cách đo nồng độ protein

Hầu hết protein hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280 nanomet (nm). Sự hấp thụ này chủ yếu đến từ hai axit amin là tryptophan và tyrosine, có trong cấu trúc protein. Máy quang phổ chiếu ánh sáng qua mẫu và đo lượng ánh sáng bị mẫu hấp thụ. Số đo này được gọi là độ hấp thụ, hoặc A280 khi được thực hiện ở 280 nm.

Đo độ hấp thụ ở 280 nm nhanh và không làm hỏng mẫu. Điều đó phân biệt phương pháp này với các phương pháp hóa học như phép thử Bradford hoặc BCA, được mô tả dưới đây. Phương pháp này cho kết quả tốt nhất với protein tinh sạch trong dung dịch, có số đo độ hấp thụ nằm trong khoảng từ khoảng 0,1 đến 1,0. Các số đo ngoài khoảng này kém tin cậy hơn, vì vậy mẫu thường cần được pha loãng trước khi đo.

Công thức tính nồng độ protein

Máy tính sắp xếp lại định luật Beer–Lambert để tính nồng độ:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — nồng độ protein, tính bằng mg/mL
• A — độ hấp thụ ở 280 nm (một số thuần túy, không có đơn vị)
• DF — hệ số pha loãng, cho biết mẫu ban đầu đã được pha loãng bao nhiêu lần trước khi đo
• ε — hệ số tắt, một hằng số đặc trưng cho protein, tính bằng L/(g·cm)
• l — chiều dài đường quang, là khoảng cách ánh sáng truyền qua mẫu, tính bằng cm (thường là 1 cm trong cuvet tiêu chuẩn, một vật chứa nhỏ bằng thủy tinh hoặc nhựa dùng trong máy quang phổ)

Để đổi kết quả sang microgam trên mililit, nhân giá trị mg/mL với 1.000. Để tìm tổng khối lượng protein trong mẫu, nhân nồng độ với thể tích mẫu tính bằng mililit.

Ví dụ minh họa

Một mẫu cho số đo độ hấp thụ là 0,5 ở 280 nm. Mẫu không được pha loãng, nên hệ số pha loãng là 1, và được đo trong cuvet tiêu chuẩn 1 cm. Protein là albumin huyết thanh bò (BSA), có hệ số tắt bằng 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Trong một mẫu 1 mL, con số đó tương đương khoảng 0,75 mg protein tổng cộng, hoặc 750 μg/mL.

Hệ số tắt của các protein phổ biến

Mỗi protein hấp thụ ánh sáng khác nhau, vì mỗi protein có số lượng gốc tryptophan và tyrosine khác nhau. Hệ số tắt mô tả đặc tính này của một protein cụ thể ở 280 nm, với đơn vị L/(g·cm). Các giá trị thường dùng gồm:

Máy tính cũng có thể nhận một hệ số tắt tùy chỉnh cho protein không có trong danh sách này. Với protein có trình tự axit amin đã biết, giá trị này có thể được ước tính bằng công thức do Gill và von Hippel công bố vào 1989: ε₂₈₀ = (số gốc tryptophan × 5.500) + (số gốc tyrosine × 1.490) + (số gốc cystine × 125). Công thức này cho kết quả theo M⁻¹cm⁻¹, một đơn vị mol, khác với các giá trị L/(g·cm) dựa trên khối lượng ở trên. Các công cụ miễn phí như ProtParam, do máy chủ ExPASy cung cấp, tính trực tiếp giá trị này từ trình tự protein.

Chiều dài đường quang và hệ số pha loãng

Chiều dài đường quang là bề rộng của cuvet chứa mẫu, được đo bằng centimet. Cuvet tiêu chuẩn rộng 1 cm. Máy quang phổ thể tích siêu nhỏ, dùng để đo các mẫu rất nhỏ, có thể sử dụng đường quang ngắn hơn nhiều, chẳng hạn 0,1 cm.

Hệ số pha loãng tính đến mọi thao tác pha loãng được thực hiện trước khi đo. Nếu mẫu đậm đặc cho độ hấp thụ cao hơn 1,0, người ta thường pha loãng mẫu trước bằng dung dịch đệm. Hệ số pha loãng bằng tổng thể tích sau pha loãng chia cho thể tích mẫu ban đầu. Ví dụ, trộn 10 μL mẫu với 990 μL dung dịch đệm tạo ra tổng thể tích 1.000 μL và hệ số pha loãng là 100.

Các cách khác để đo nồng độ protein

Độ hấp thụ ở 280 nm là một trong một số phương pháp phổ biến được sử dụng trong phòng thí nghiệm.

• Phép thử Bradford: sử dụng thuốc nhuộm đổi màu khi liên kết với protein. Phương pháp này hiệu quả với các mẫu chưa tinh sạch, nhưng mức độ đổi màu có thể khác nhau giữa các protein.
• Phép thử BCA: dựa trên sự đổi màu do các liên kết peptit của protein gây ra. Phương pháp này tương thích với nhiều chất tẩy rửa, nhưng cần nhiều thời gian thực hiện hơn phép đo độ hấp thụ trực tiếp.
• Phương pháp Lowry: một phương pháp cũ, có độ nhạy rất cao nhưng phản ứng kém với một số thành phần phổ biến của dung dịch đệm.

Cả ba phương pháp này đều làm hỏng mẫu. Phép đo A280 trực tiếp thì không, nên có thể thu hồi và sử dụng lại cùng mẫu đó.

Các câu hỏi thường gặp

Khoảng độ hấp thụ lý tưởng cho phương pháp này là bao nhiêu?

Từ 0,1 đến 1,0. Dưới 0,1, số đo không chính xác. Trên 1,0, mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ có thể không còn là đường thẳng, vì vậy mẫu nên được pha loãng trước.

Vì sao đo ở 280 nm thay vì 260 nm?

Axit nucleic, chẳng hạn DNA và RNA, hấp thụ mạnh ở 260 nm. Protein hấp thụ nhiều hơn ở 280 nm do chứa tryptophan và tyrosine. Đo ở 280 nm làm giảm ảnh hưởng của axit nucleic có trong mẫu.

Làm thế nào xác định hệ số tắt của protein không có trong danh sách?

Với protein có trình tự đã biết, một công cụ như ProtParam tính hệ số này dựa trên số gốc tryptophan, tyrosine và cystine. Hệ số cũng có thể được đo trực tiếp bằng cách so sánh độ hấp thụ của mẫu với một dung dịch có nồng độ đã biết.

Phương pháp này có hiệu quả với hỗn hợp protein không?

Phương pháp này hiệu quả nhất với một protein đơn lẻ, đã tinh sạch và có hệ số tắt đã biết. Hỗn hợp các protein chưa biết, chẳng hạn dịch ly giải tế bào, thường được đo bằng phép thử Bradford hoặc BCA thay thế, vì các phương pháp đó cho ước tính tổng lượng protein nhất quán hơn.

Chất tẩy rửa có thể ảnh hưởng đến số đo không?

Có. Nhiều chất tẩy rửa hấp thụ ánh sáng gần 280 nm, có thể làm sai lệch kết quả. Sử dụng mẫu trắng chứa cùng nồng độ chất tẩy rửa giúp loại bỏ độ hấp thụ nền đó. Nồng độ chất tẩy rửa rất cao có thể đòi hỏi một phép thử tương thích với chất tẩy rửa, chẳng hạn BCA.