Máy Tính Nồng Độ DNA | Công Cụ Chuyển Đổi A260 sang ng/μL

Máy tính nồng độ DNA

Máy tính nồng độ DNA chuyển đổi số đo độ hấp thụ UV tại 260 nanomet, gọi là A260, thành nồng độ DNA tính bằng nanogram trên microlit (ng/µL). Công cụ này cũng cho biết tổng lượng DNA trong mẫu, tính bằng microgam (µg).

Độ hấp thụ A260 là gì?

A260 là lượng tia cực tím mà một dung dịch hấp thụ tại bước sóng 260 nanomet. DNA hấp thụ tia UV mạnh nhất ở gần bước sóng này do các base nucleotide. Máy quang phổ đo A260 sau khi đo mẫu trắng, trong đó mẫu trắng sử dụng cùng loại đệm với mẫu để loại bỏ độ hấp thụ nền. Lượng DNA trong dung dịch càng nhiều thì số đo A260 càng cao.

Công thức tính nồng độ DNA

DNA mạch kép hấp thụ tia UV tỷ lệ với nồng độ của nó; mối quan hệ này được gọi là định luật Beer–Lambert. Với đường truyền quang dài 1 centimet, dung dịch có số đo A260 bằng 1,0 chứa khoảng 50 ng/µL DNA mạch kép. Giá trị này, tức hệ số chuyển đổi, dùng để chuyển mọi số đo A260 thành nồng độ:

Nồng độ DNA (ng/µL) = A260 × 50 × hệ số pha loãng

Hệ số pha loãng tính đến mọi lần pha loãng được thực hiện trước khi đo mẫu. Mẫu được đo mà không pha loãng có hệ số pha loãng là 1.

Cách tính tổng lượng DNA thu được

Khi đã biết nồng độ, có thể tính tổng khối lượng DNA trong mẫu từ thể tích của mẫu:

Tổng DNA (µg) = nồng độ (ng/µL) × thể tích (µL) ÷ 1000

Cách tính nồng độ DNA: từng bước

1. Trộn kỹ mẫu trước khi đo. DNA có thể bám vào thành ống hoặc lắng không đều.
2. Pha loãng mẫu nếu mẫu có nồng độ cao, sao cho số đo A260 nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,0. Số đo của máy quang phổ kém tin cậy nhất khi nằm ngoài khoảng này.
3. Đặt mẫu trắng cho máy quang phổ bằng cùng loại đệm dùng để pha loãng, sau đó đo mẫu tại 260 nm.
4. Nhập số đo A260, thể tích mẫu và hệ số pha loãng vào máy tính để nhận nồng độ và tổng lượng DNA thu được. Cả ba ô phải được điền và thể tích phải lớn hơn 0 thì kết quả mới xuất hiện.

Ví dụ minh họa

Ví dụ 1: mẫu chưa pha loãng

Số đo A260 là 0,5, không pha loãng (hệ số pha loãng 1), thể tích mẫu là 100 µL.

• Nồng độ = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Tổng DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Ví dụ 2: mẫu đã pha loãng

Một ống chứa 50 µL DNA tinh sạch. Một phần nhỏ trong đó được pha loãng 10 lần và phần đã pha loãng cho số đo A260 là 0,75. Hệ số pha loãng chuyển số đo đó về nồng độ trong ống ban đầu, còn 50 µL là thể tích được nhập cho bước tính tổng lượng DNA.

• Nồng độ = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Tổng DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Tính hệ số pha loãng

Hệ số pha loãng = tổng thể tích sau khi pha loãng ÷ thể tích mẫu ban đầu.

Thêm 5 µL dung dịch DNA vào 45 µL đệm tạo tổng thể tích 50 µL, vì vậy hệ số pha loãng là 50 ÷ 5 = 10. Mẫu không được pha loãng có hệ số pha loãng là 1.

Khoảng nồng độ DNA điển hình

Nồng độ phụ thuộc vào loại mẫu và phương pháp tách chiết. Nồng độ DNA hệ gen sau tách chiết thường nằm trong khoảng từ khoảng 10 đến 100 ng/µL. Các chế phẩm DNA plasmid thường cho nồng độ cao hơn, đôi khi đạt vài trăm ng/µL. Kết quả lệch xa khoảng dự kiến của một phương pháp có thể cho thấy vấn đề ở quá trình tách chiết hoặc bản thân phép đo.

Giới hạn của phép đo độ hấp thụ UV

Đo A260 nhanh, nhưng đây không phải phương pháp nhạy hoặc đặc hiệu nhất đối với DNA. Protein, RNA và một số thành phần đệm cũng hấp thụ ánh sáng gần 260 nm và có thể làm tăng số đo. Các nhà khoa học thường kiểm tra tỷ số A260/A280 cùng với nồng độ để sàng lọc tạp nhiễm protein; tỷ số gần 1,8 thường cho thấy mẫu DNA tinh khiết. Các phương pháp dùng thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn phép thử Qubit, chỉ gắn với DNA mạch kép và cho số đo chính xác hơn đối với mẫu loãng hoặc không tinh khiết, dù cần thêm thuốc thử và máy đo huỳnh quang.

Các câu hỏi thường gặp

Tính nồng độ DNA từ A260 như thế nào?

Nhân số đo A260 với 50, hệ số chuyển đổi tiêu chuẩn đối với DNA mạch kép, sau đó nhân với hệ số pha loãng. Nếu mẫu không được pha loãng, dùng hệ số pha loãng 1.

Tỷ số A260/A280 bao nhiêu là tốt?

Tỷ số gần 1,8 thường cho thấy mẫu DNA tinh khiết. Tỷ số thấp hơn cho thấy có thể bị tạp nhiễm protein. Tỷ số cao hơn 2,0 có thể cho thấy bị tạp nhiễm RNA.

Có thể dùng máy tính này cho RNA không?

Không trực tiếp, vì RNA dùng hệ số chuyển đổi 40 ng/µL thay vì 50. Để ước tính nồng độ RNA, nhân kết quả của máy tính với 0,8 (40 ÷ 50), hoặc tính trực tiếp A260 × 40 × hệ số pha loãng.

Vì sao số đo A260 nên nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,0?

Độ hấp thụ gần như tỷ lệ với nồng độ, theo mô tả của định luật Beer–Lambert, chủ yếu trong khoảng này. Ngoài khoảng đó, số đo trở nên kém tin cậy hơn, vì vậy mẫu quá đậm đặc hoặc quá loãng nên được pha loãng hoặc cô đặc trước khi đo lại.

Nồng độ và độ tinh khiết khác nhau như thế nào?

Nồng độ cho biết lượng DNA hiện có, tính bằng ng/µL. Độ tinh khiết cho biết mức độ sạch của mẫu, chủ yếu được đánh giá từ các tỷ số độ hấp thụ như A260/A280. Một mẫu có thể có nồng độ cao nhưng vẫn không tinh khiết, hoặc nồng độ thấp nhưng rất tinh khiết.

Chuyển đổi ng/µL sang µg/mL như thế nào?

Hai đơn vị này có giá trị số bằng nhau. 1 ng/µL bằng 1 µg/mL, vì cả đơn vị khối lượng và đơn vị thể tích đều thay đổi theo hệ số 1000.

Tài liệu tham khảo

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (lần xuất bản thứ 3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Định lượng DNA và RNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ và huỳnh quang. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Giá trị của tỷ số A260/A280 trong đo độ tinh khiết của axit nucleic. BioTechniques, 19(2), 208–210.