Tính toán nồng độ DNA từ các phép đo độ hấp thụ (A260) với các yếu tố pha loãng có thể điều chỉnh. Công cụ thiết yếu cho các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và nghiên cứu di truyền.
Nồng độ DNA được tính toán bằng công thức sau:
Một máy tính nồng độ DNA là một công cụ trực tuyến thiết yếu giúp các nhà sinh học phân tử, nhà di truyền học và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm xác định chính xác nồng độ DNA từ các phép đo quang phổ. Máy tính miễn phí này sử dụng phương pháp A260 tiêu chuẩn để chuyển đổi các phép đo hấp thụ UV thành các giá trị nồng độ DNA chính xác trong ng/μL.
Đo lường nồng độ DNA là một quy trình cơ bản trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, đóng vai trò là một bước kiểm soát chất lượng quan trọng trước khi thực hiện PCR, giải trình tự, nhân bản và các kỹ thuật phân tử khác. Máy tính của chúng tôi loại bỏ các phép tính thủ công và giảm thiểu sai sót khi xác định cả nồng độ và tổng lượng DNA trong các mẫu của bạn.
Tính toán nồng độ DNA dựa trên Định Luật Beer-Lambert, quy định rằng độ hấp thụ của một dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ của các chất hấp thụ trong dung dịch và chiều dài đường đi của ánh sáng qua dung dịch. Đối với DNA chuỗi đôi, độ hấp thụ 1.0 tại 260nm (A260) trong một cuvet có chiều dài 1cm tương ứng với nồng độ khoảng 50 ng/μL.
Nồng độ DNA được tính bằng công thức sau:
Trong đó:
Tổng lượng DNA trong mẫu có thể được tính bằng:
Độ Hấp Thụ Tại 260nm (A260):
Hệ Số Chuyển Đổi (50):
Hệ Số Pha Loãng:
Thể Tích:
Thực hiện quy trình đơn giản này để tính toán nồng độ DNA từ các phép đo A260 của bạn:
Đo lường nồng độ DNA là điều cần thiết cho nhiều ứng dụng sinh học phân tử và nghiên cứu:
Trước khi nối các đoạn DNA vào vector, việc biết nồng độ chính xác cho phép các nhà nghiên cứu tính toán tỷ lệ tối ưu giữa đoạn chèn và vector, tối đa hóa hiệu suất chuyển đổi. Ví dụ, tỷ lệ mol 3:1 giữa đoạn chèn và vector thường mang lại kết quả tốt nhất, điều này yêu cầu đo lường nồng độ chính xác của cả hai thành phần.
Các phản ứng PCR thường yêu cầu 1-10 ng DNA mẫu để khuếch đại tối ưu. Quá ít DNA có thể dẫn đến thất bại trong khuếch đại, trong khi quá nhiều có thể ức chế phản ứng. Đối với PCR định lượng (qPCR), việc định lượng DNA chính xác hơn là cần thiết để đảm bảo các đường chuẩn chính xác và định lượng đáng tin cậy.
Các quy trình chuẩn bị thư viện NGS chỉ định các lượng DNA đầu vào chính xác, thường trong khoảng 1-500 ng tùy thuộc vào nền tảng và ứng dụng. Đo lường nồng độ chính xác là điều cần thiết cho việc chuẩn bị thư viện thành công và đại diện cân bằng của các mẫu trong các lần giải trình tự đa dạng.
Khi đưa DNA vào tế bào eukaryote, lượng DNA tối ưu thay đổi tùy theo loại tế bào và phương pháp chuyển gien. Thông thường, 0.5-5 μg DNA plasmid được sử dụng cho mỗi giếng trong định dạng 6 giếng, yêu cầu đo lường nồng độ chính xác để chuẩn hóa các thí nghiệm.
Trong các ứng dụng hình sự, các mẫu DNA thường bị giới hạn và quý giá. Đo lường chính xác cho phép các nhà khoa học hình sự xác định xem có đủ DNA để phân tích hay không và chuẩn hóa lượng DNA được sử dụng trong các phân tích tiếp theo.
Các enzyme cắt có các đơn vị hoạt động cụ thể được xác định trên mỗi μg DNA. Biết nồng độ DNA chính xác cho phép tỷ lệ enzyme-to-DNA phù hợp, đảm bảo tiêu hóa hoàn toàn mà không có hoạt động sao (cắt không đặc hiệu).
Mặc dù quang phổ UV là phương pháp phổ biến nhất để định lượng DNA, một số phương pháp thay thế tồn tại:
Phương Pháp Huỳnh Quang:
Điện Di Gel Agarose:
PCR Thời Gian Thực:
PCR Kỹ Thuật Số:
Khả năng đo lường chính xác nồng độ DNA đã phát triển đáng kể cùng với những tiến bộ trong sinh học phân tử:
Sau khi phát hiện cấu trúc DNA bởi Watson và Crick vào năm 1953, các nhà khoa học bắt đầu phát triển các phương pháp để tách và định lượng DNA. Các phương pháp sớm dựa vào các thử nghiệm màu như phản ứng diphenylamine, tạo ra màu xanh khi phản ứng với đường deoxyribose trong DNA. Những phương pháp này tương đối không nhạy và dễ bị can thiệp.
Việc áp dụng quang phổ UV vào định lượng axit nucleic trở nên phổ biến vào những năm 1970. Các nhà khoa học phát hiện rằng DNA hấp thụ ánh sáng UV với mức tối đa tại 260nm, và rằng mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ là tuyến tính trong một khoảng nhất định. Hệ số chuyển đổi 50 ng/μL cho DNA chuỗi đôi tại A260 = 1.0 đã được thiết lập trong giai đoạn này.
Sự phát triển của các thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu cho DNA trong những năm 1980 và 1990 đã cách mạng hóa việc định lượng DNA, đặc biệt là cho các mẫu loãng. Các thuốc nhuộm Hoechst và sau này là PicoGreen cho phép phát hiện nhạy hơn nhiều so với quang phổ. Những phương pháp này trở nên đặc biệt quan trọng với sự ra đời của PCR, thường yêu cầu định lượng chính xác các lượng DNA nhỏ.
Sự ra đời của các máy quang phổ vi mô như NanoDrop vào đầu những năm 2000 đã biến đổi việc định lượng DNA hàng ngày bằng cách chỉ yêu cầu 0.5-2 μL mẫu. Công nghệ này đã loại bỏ nhu cầu về các pha loãng và cuvet, làm cho quy trình nhanh hơn và thuận tiện hơn.
Ngày nay, các kỹ thuật tiên tiến như PCR kỹ thuật số và giải trình tự thế hệ mới đã đẩy ranh giới của việc định lượng DNA xa hơn nữa, cho phép định lượng tuyệt đối các trình tự cụ thể và phát hiện phân tử đơn. Tuy nhiên, nguyên tắc quang phổ cơ bản được thiết lập hàng thập kỷ trước vẫn là nền tảng của việc đo lường nồng độ DNA hàng ngày trong các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Hãy cùng đi qua một số ví dụ thực tế về tính toán nồng độ DNA:
Một nhà nghiên cứu đã tinh chế một plasmid và thu được các phép đo sau:
Tính toán:
Sau khi chiết xuất DNA genomic từ máu:
Tính toán:
Một quy trình giải trình tự yêu cầu chính xác 500 ng DNA:
Thể tích cần thiết = 500 ÷ 125 = 4 μL dung dịch DNA
Dưới đây là các ví dụ về cách tính nồng độ DNA trong các ngôn ngữ lập trình khác nhau:
1' Công thức Excel cho nồng độ DNA
2=A260*50*HệSốPhaLoãng
3
4' Công thức Excel cho tổng lượng DNA trong μg
5=(A260*50*HệSốPhaLoãng*ThểTích)/1000
6
7' Ví dụ trong một ô với A260=0.5, HệSốPhaLoãng=2, ThểTích=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Kết quả: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Tính toán nồng độ DNA trong ng/μL
4
5 Tham số:
6 absorbance (float): Giá trị độ hấp thụ tại 260nm
7 dilution_factor (float): Hệ số pha loãng của mẫu
8
9 Trả về:
10 float: Nồng độ DNA trong ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15 """
16 Tính toán tổng lượng DNA trong μg
17
18 Tham số:
19 concentration (float): Nồng độ DNA trong ng/μL
20 volume_ul (float): Thể tích dung dịch DNA trong μL
21
22 Trả về:
23 float: Tổng lượng DNA trong μg
24 """
25 return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Ví dụ sử dụng
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Nồng Độ DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Tổng DNA: {total_dna:.2f} μg")
371function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2 // Trả về nồng độ DNA trong ng/μL
3 return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7 // Trả về tổng lượng DNA trong μg
8 return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Ví dụ sử dụng
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`Nồng Độ DNA: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Tổng DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21public class DNACalculator { /** *
Khám phá thêm các công cụ có thể hữu ích cho quy trình làm việc của bạn