Máy Tính Nối Mạch DNA - Tính Tỷ Lệ Chèn:Vector cho Nhân Dòng Phân Tử

Phản ứng nối DNA là bước trong nhân dòng phân tử, trong đó một đoạn chèn được nối với vector plasmid nhờ enzyme DNA ligase T4. Công cụ tính phản ứng nối DNA tính thể tích bao nhiêu microlit DNA đoạn chèn và DNA vector cần trộn để phản ứng đạt tỷ lệ mol đoạn chèn trên vector đã chọn.

Chức năng của máy tính

Công cụ tính nhận sáu đầu vào: nồng độ vector, chiều dài vector, nồng độ đoạn chèn, chiều dài đoạn chèn, tỷ lệ mol mục tiêu của đoạn chèn trên vector và tổng thể tích phản ứng. Công cụ cũng cho phép đặt lượng DNA vector cần dùng, mặc định là 50 nanogram (ng). Từ các giá trị này, công cụ tính thể tích vector cần hút bằng pipet, thể tích đoạn chèn cần hút bằng pipet và lượng dung dịch đệm hoặc nước cần thêm để đạt tổng thể tích phản ứng.

Nồng độ được đo bằng nanogram trên microlit (ng/μL), thường được đọc từ thiết bị Nanodrop hoặc Qubit. Chiều dài được đo bằng cặp base (bp). Một kilobase (kb) bằng 1000 cặp base. Tỷ lệ mol cho biết cần có bao nhiêu phân tử đoạn chèn tương ứng với mỗi phân tử vector. Đây không phải là tỷ lệ khối lượng.

Vì sao dùng tỷ lệ mol thay vì khối lượng

Các lượng DNA có cùng khối lượng không chứa cùng số phân tử. Một đoạn chèn ngắn có khối lượng nhỏ hơn một vector dài nếu số phân tử của chúng bằng nhau. Nếu trộn các lượng nanogram bằng nhau của một đoạn chèn ngắn và một vector dài, số phân tử đoạn chèn sẽ thấp hơn nhiều so với số phân tử vector. Công cụ tính điều chỉnh khối lượng đoạn chèn theo tỷ lệ chiều dài các đoạn, để hỗn hợp cuối cùng có số phân tử đoạn chèn trên mỗi phân tử vector đúng như dự kiến.

Công thức nối DNA

Lượng DNA đoạn chèn cần dùng, tính bằng nanogram, là:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

trong đó $m_i$ là lượng đoạn chèn tính bằng nanogram, $m_v$ là lượng vector tính bằng nanogram, $k_i$ là chiều dài đoạn chèn tính bằng kilobase, $k_v$ là chiều dài vector tính bằng kilobase, còn R là tỷ lệ mol mục tiêu của đoạn chèn trên vector.

Sau khi biết lượng này, công cụ tính chuyển từng lượng thành thể tích có thể hút bằng pipet:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

trong đó $V_v$ và $V_i$ là thể tích vector và đoạn chèn tính bằng microlit, $c_v$ và $c_i$ là nồng độ vector và đoạn chèn tính bằng nanogram trên microlit, $V_b$ là thể tích dung dịch đệm, còn $V_t$ là tổng thể tích phản ứng.

Nếu tổng thể tích vector và đoạn chèn lớn hơn tổng thể tích phản ứng thì không còn chỗ cho dung dịch đệm, ligase hoặc nước. Khi đó, công cụ báo tổng thể tích quá nhỏ thay vì hiển thị lượng dung dịch đệm âm.

Ví dụ minh họa

Một nhà nghiên cứu đang nhân bản một đoạn gene dài 1 kb vào một vector plasmid dài 3 kb. Kế hoạch là dùng 50 ng DNA vector với tỷ lệ mol đoạn chèn:vector là 3:1, trong phản ứng có thể tích 20 μL.

Đầu vào:

• Nồng độ vector: 50 ng/μL
• Chiều dài vector: 3000 bp (3 kb)
• Nồng độ đoạn chèn: 25 ng/μL
• Chiều dài đoạn chèn: 1000 bp (1 kb)
• Tỷ lệ mol: 3
• Tổng thể tích: 20 μL
• Lượng vector: 50 ng

Bước 1: lượng đoạn chèn

ng đoạn chèn = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Bước 2: thể tích

Thể tích vector = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Thể tích đoạn chèn = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Thể tích dung dịch đệm = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Phản ứng gồm 1 μL vector, 2 μL đoạn chèn và 17 μL dung dịch đệm hoặc nước; đây cũng là phần thêm ligase và dung dịch đệm phản ứng của enzyme. Hỗn hợp này tạo ra ba phân tử đoạn chèn cho mỗi phân tử vector.

Các tỷ lệ mol thường dùng cho phản ứng nối

Hầu hết các phản ứng nhân bản tiêu chuẩn với các đầu dính có phần nhô ra đều dùng tỷ lệ đoạn chèn:vector là 3:1. Phản ứng nối các đầu tù kém hiệu quả hơn, nên thường dùng tỷ lệ cao hơn, chẳng hạn 5:1. Các đoạn chèn rất lớn đôi khi hoạt động tốt hơn với tỷ lệ thấp hơn, gần 1:1, vì mỗi phân tử đoạn lớn vốn đã đóng góp nhiều cặp base.

Các câu hỏi thường gặp

Phản ứng nối DNA là gì?

Phản ứng nối DNA là sự nối hai đoạn DNA, thường là một vector plasmid và một đoạn chèn, thành một phân tử liên tục. Enzyme ligase DNA T4 hàn kín mối nối giữa các đầu của hai đoạn.

Tỷ lệ mol đoạn chèn:vector có nghĩa là gì?

Đó là số phân tử DNA đoạn chèn có mặt trong phản ứng tương ứng với mỗi phân tử vector. Tỷ lệ 3:1 có nghĩa là có ba phân tử đoạn chèn cho mỗi phân tử vector, bất kể khối lượng của chúng so sánh với nhau như thế nào.

Vì sao không dùng lượng nanogram bằng nhau của vector và đoạn chèn?

Các đoạn DNA có chiều dài khác nhau có khối lượng trên mỗi phân tử khác nhau. Một đoạn chèn 1 kb có khối lượng chỉ khoảng một phần ba so với một vector 3 kb, nếu xét từng phân tử. Các lượng nanogram bằng nhau của mỗi loại sẽ không tạo ra số phân tử bằng nhau, nên công cụ tính điều chỉnh khối lượng đoạn chèn để phù hợp với tỷ lệ mol mục tiêu.

Tổng thể tích quá nhỏ có nghĩa là gì?

Điều đó có nghĩa là chỉ riêng thể tích vector và đoạn chèn đã chiếm toàn bộ thể tích phản ứng, không còn chỗ cho dung dịch đệm hoặc ligase. Cách khắc phục là tăng tổng thể tích phản ứng hoặc dùng các dung dịch DNA gốc có nồng độ cao hơn.

Có thể dùng công cụ tính này cho phương pháp Gibson Assembly hoặc nhân dòng Golden Gate không?

Không. Các phương pháp đó sử dụng hóa học phản ứng khác và thường nhắm đến lượng đẳng mol của tất cả các đoạn thay vì một tỷ lệ đoạn chèn:vector cố định. Cách tính thể tích của chúng khác với phản ứng nối DNA tiêu chuẩn dùng DNA ligase T4.

Thường dùng bao nhiêu DNA vector?

50 ng là lượng ban đầu thường dùng cho một phản ứng nối tiêu chuẩn. Các phòng thí nghiệm cũng sử dụng lượng từ 25 đến 100 ng, được điều chỉnh theo nồng độ DNA và quy mô phản ứng.