حاسبة قابلية الذوبان للبروتين - أداة مجانية للدلالة الهيدروجينية ودرجة الحرارة

تقدّر حاسبة ذوبانية البروتين أعلى تركيز للبروتين يمكن أن يظل ذائبًا في مذيب عند قيمة pH ودرجة حرارة وقوة أيونية محددة. وتحول الكيمياء الأساسية إلى رقم واحد، بوحدة مليغرام من البروتين لكل مليلتر من المذيب.

تهم ذوبانية البروتين في الكيمياء الحيوية وتركيب الأدوية وعلوم الأغذية. فالبروتين الذي لا يظل ذائبًا يكوّن تجمعات أو رواسب، مما قد يفسد تجربة أو يجعل حقن دواء أمرًا مستحيلًا.

كيفية حساب ذوبانية البروتين

تعتمد الذوبانية على خمسة عوامل: نقطة التعادل الكهربائي للبروتين (قيمة pH التي تكون عندها شحنته الصافية صفرًا)، ودرجة انصهاره (درجة الحرارة التي يبدأ عندها في فقدان بنيته المطوية)، وثابت العزل الكهربائي للمذيب (مقياس لمدى فعاليته في فصل الجسيمات المشحونة)، وقيمة pH للمحلول، والقوة الأيونية (مقياس لكمية الملح الذائب الموجودة).

تبدأ الحاسبة من الذوبانية المعروفة لكل بروتين في الماء عند شروط مرجعية محددة: 25 °م، وقيمة pH مقدارها 7.0، وقوة أيونية مقدارها 0.15 M (وهو تقريبًا مستوى الملح في الدم). ثم تضرب تلك القيمة المرجعية في أربع نسب، واحدة لكل شرط تغيّر.

معادلة ذوبانية البروتين

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• تمثل $S_{ref}$ الذوبانية المعروفة للبروتين في الماء عند الشروط المرجعية، بوحدة ملغ/مل.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$، حيث تمثل $pI$ نقطة التعادل الكهربي للبروتين. تكون الذوبانية في أدنى مستوياتها عند نقطة التعادل الكهربي، وترتفع كلما ابتعدت قيمة pH عنها، ثم تستقر خلال بضع وحدات من pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$، حيث تمثل $I$ القوة الأيونية بوحدة مول لكل لتر. عند مستويات الملح المنخفضة، يزيد هذا الحد من الذوبانية قليلًا («زيادة الذوبانية بفعل الملح»). وعند مستويات الملح المرتفعة، يقللها («انخفاض الذوبانية بفعل الملح»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$، حيث تمثل $T_m$ نقطة انصهار البروتين بوحدة °C. ترتفع الذوبانية تدريجيًا مع درجة الحرارة، ثم تنخفض بشدة عندما تقترب درجة الحرارة من $T_m$ ويبدأ البروتين في فقدان بنيته المطوية.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$، حيث يمثل $\varepsilon$ ثابت العزل الكهربائي للمذيب. يبلغ ثابت العزل الكهربائي للماء 78.4، ولذلك يساوي هذا الحد 1 في الماء. وتخفض المذيبات التي تفصل الشحنات بفعالية أقل من الماء، مثل الإيثانول، الذوبانية.

القيم المرجعية التي تستخدمها الحاسبة

تصنيفات الذوبانية

مثال: الألبومين في محلول منظم الفوسفات

احسب ذوبانية الألبومين في محلول منظم الفوسفات عند 25 °م، وقيمة pH مقدارها 7.4، وقوة أيونية مقدارها 0.15 M.

القيم المرجعية للألبومين هي $pI = 4.7$، و$S_{ref} = 500$ ملغ/مل، و$T_m = 63°C$. ويبلغ ثابت العزل الكهربائي لمحلول منظم الفوسفات 76.0.

1. حد pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. النسبة: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. الحد الأيوني: تساوي القوة الأيونية (0.15 M) القيمة المرجعية، ولذلك تكون النسبة 1.
3. حد درجة الحرارة: تساوي درجة الحرارة (25 °م) القيمة المرجعية، ولذلك تكون النسبة 1.
4. حد المذيب: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ ملغ/مل}$

تعرض الحاسبة النتيجة 492.12 mg/مل، وهي تقع ضمن فئة «قابل للذوبان بدرجة عالية».

مثال: الليزوزيم في الغليسرين عند درجة حرارة منخفضة

احسب ذوبانية الليزوزيم في محلول غليسرول عند 4 °م، وقيمة pH مقدارها 5.0، وقوة أيونية مقدارها 0.1 M. وهذه شروط مشابهة لتخزين إنزيم في درجة حرارة منخفضة.

القيم المرجعية لليزوزيم هي $pI = 11.35$، و$S_{ref} = 250$ ملغ/مل، و$T_m = 72°C$. ويبلغ ثابت العزل الكهربائي للغليسرول 42.5.

1. مصطلح الأس الهيدروجيني: يؤدي الانتقال من الأس الهيدروجيني 7.0 إلى الأس الهيدروجيني 5.0 (وكلاهما أقل بكثير من قيمة نقطة التعادل الكهربي البالغة 11.35) إلى تغيير طفيف فقط في مصطلح الأس الهيدروجيني. النسبة: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. الحد الأيوني: يؤدي خفض القوة الأيونية من 0.15 M إلى 0.1 M إلى رفع الذوبانية قليلًا بفعل تأثير زيادة الذوبان بالملح. النسبة: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$
3. مصطلح درجة الحرارة: يؤدي التبريد من 25 °م إلى 4 °م، أي أقل بكثير من نقطة الانصهار، إلى خفض المصطلح. النسبة: 0.8106.
4. حد المذيب: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ ملغ/مل}$

تعرض الحاسبة النتيجة 35.88 mg/مل، وهي تقع ضمن فئة «قابل للذوبان». إن ثابت العزل الكهربائي المنخفض للغليسرول، وليس درجة الحرارة المنخفضة، هو ما يخفض النتيجة عن القيمة المرجعية.

كيفية استخدام حاسبة ذوبانية البروتين

1. اختر بروتينًا من القائمة: الألبومين، أو الإنسولين، أو الليزوزيم، أو الهيموغلوبين، أو الميوغلوبين، أو الكولاجين، أو الكازين، أو الفيبرينوجين.
2. اختر مذيبًا: الماء، أو محلول منظم الفوسفات، أو محلول منظم تريس، أو الغليسرول، أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد، أو الميثانول، أو الإيثانول، أو الأسيتون.
3. أدخل درجة الحرارة بوحدة °C (من 0 إلى 100)، وقيمة pH (من 0 إلى 14)، والقوة الأيونية بوحدة مولارية (من 0 إلى 2).
4. اقرأ الذوبانية المحسوبة بوحدة ملغ/مل وفئتها. ويعرض شريط أسفل النتيجة القيمة على مقياس من 0 إلى 100 mg/مل، ويمتلئ بالكامل عند 100 mg/مل أو أكثر.

العوامل المؤثرة في ذوبانية البروتين

الأس الهيدروجيني ونقطة التعادل الكهربي. لكل بروتين نقطة كهربية متعادلة، وهي قيمة pH التي تكون عندها سطوحه بلا شحنة كهربائية صافية. عند تلك القيمة، لا تتنافر جزيئات البروتين بعضها مع بعض، فتتكتل وتخرج من المحلول بسهولة أكبر. ويمنح تحريك قيمة pH بعيدًا عن النقطة الكهربية المتعادلة، في أي من الاتجاهين، البروتين شحنة صافية. وتتَنافر الجزيئات المشحونة بعضها مع بعض، مما يبقيها منفصلة وذائبة.

القوة الأيونية. تحيط أيونات الملح الذائبة بالمجموعات المشحونة على سطح البروتين. وعند التراكيز المنخفضة إلى المتوسطة، تحجب هذه الأيونات الشحنات التي قد تجذب جزيئي بروتين إلى بعضهما، مما يزيد الذوبانية. ويُسمى ذلك التمليح الداخلي. أما عند تراكيز الملح المرتفعة، فتتنافس الأيونات مع البروتين على جزيئات الماء، فتزيل طبقة الماء التي تُبقي البروتين ذائبًا. ويُسمى ذلك التمليح الخارجي، وهو أساس طريقة تنقية شائعة تُستخدم فيها كبريتات الأمونيوم لترسيب البروتينات من الخليط.

درجة الحرارة. يزيد تدفئة المحلول عمومًا من الذوبانية حتى حد معين. وعندما تقترب درجة الحرارة من نقطة انصهار البروتين، يبدأ البروتين في فقدان بنيته المطوية. ويكشف هذا التغير أجزاء كارهة للماء من البروتين تكون مخفية عادة داخل بنيته المطوية. وتلتصق هذه الأجزاء المكشوفة بعضها ببعض، مما يسبب التكتل، ولذلك تنخفض الذوبانية بشدة عند نقطة الانصهار وفوقها.

المذيب. يقيس ثابت العزل الكهربائي للمذيب مدى فعاليته في إضعاف التجاذب الكهربائي بين الجسيمات المشحونة. للماء ثابت عزل كهربائي مرتفع، ويفصل الشحنات جيدًا، ولذلك تذوب معظم البروتينات في الماء أفضل من ذوبانها في المذيبات العضوية مثل الإيثانول أو الأسيتون. وتسمح المذيبات ذات ثابت العزل الكهربائي المنخفض للشحنات المتعاكسة على جزيئات البروتين المختلفة بالتجاذب بقوة أكبر، مما يشجع التكتل.

القيود

تستخدم الحاسبة نموذجًا مبسطًا مبنيًا على مجموعة صغيرة من البروتينات المرجعية والمذيبات القياسية. ولا يأخذ النموذج في الحسبان نقاء البروتين، أو الإضافات مثل المنظفات أو المواد المثبتة، أو مكونات المحاليل المنظمة غير المعتادة. والنتائج تقديرات لتخطيط التجارب، وليست بديلًا عن قياس الذوبانية مباشرة في المختبر.

الأسئلة الشائعة

ما ذوبانية البروتين؟ ذوبانية البروتين هي أعلى تركيز لبروتين يظل ذائبًا بالكامل في مذيب، من دون تكوين تجمعات أو رواسب مرئية.

لماذا تكون ذوبانية البروتين في أدنى مستوياتها عند نقطته الكهربية المتعادلة؟ عند النقطة الكهربية المتعادلة، لا تحمل جزيئات البروتين شحنة كهربائية صافية، ولذلك لا تعود تتنافر كهربائيًا. ومن دون هذا التنافر، يُرجح أن تلتصق ببعضها وتخرج من المحلول.

ما الفرق بين التمليح الداخلي والتمليح الخارجي؟ يحدث التمليح الداخلي عند تراكيز الملح المنخفضة، إذ تحجب الأيونات الذائبة المجموعات المشحونة في البروتين عن بعضها وتزيد الذوبانية. ويحدث التمليح الخارجي عند تراكيز الملح المرتفعة، إذ تزيل الأيونات الماء من سطح البروتين وتخفض الذوبانية.

هل تزيد درجة الحرارة المرتفعة الذوبانية دائمًا؟ لا. تميل الذوبانية إلى الارتفاع مع درجة الحرارة حتى حد معين فقط. وعندما تقترب درجة الحرارة من نقطة انصهار البروتين، يبدأ البروتين في فقدان بنيته المطوية، مما يسبب عادةً التكتل وانخفاضًا حادًا في الذوبانية.

لماذا تذوب البروتينات بدرجة أقل في الإيثانول أو الأسيتون منها في الماء؟ للماء ثابت عزل كهربائي مرتفع، أي إنه يضعف التجاذب الكهربائي بين الأجزاء المشحونة من جزيئات البروتين بفعالية كبيرة. أما الإيثانول والأسيتون فلهما ثوابت عزل كهربائي أقل، ولذلك تتجاذب المجموعات المشحونة على جزيئات البروتين المختلفة بقوة أكبر في هذين المذيبين، مما يزيد احتمال التكتل.

ما مدى دقة هذه الحاسبة؟ تقدم تقديرًا يستند إلى نموذج فيزيائي وإلى مجموعة صغيرة من البروتينات والمذيبات المرجعية. وهي مفيدة لتضييق نطاق الشروط التي ينبغي اختبارها، لكن القياس التجريبي يظل الطريقة الوحيدة لتأكيد ذوبانية عينة بروتين محددة.

قراءات إضافية

• أراكاوا، ت.، وتيماشيف، س. ن. (1984). آلية التمليح الداخلي والخارجي للبروتين بواسطة أملاح الكاتيونات ثنائية التكافؤ. الكيمياء الحيوية، 23(25)، 5912–5923.
• تريفينو، س. ر.، وشولتز، ج. م.، وبايس، س. ن. (2008). قياس ذوبانية البروتين وزيادتها. مجلة العلوم الصيدلانية، 97(10)، 4155–4166.
• كوهن، إ. ج.، وإدسال، ج. ت. (1943). البروتينات والأحماض الأمينية والببتيدات بوصفها أيونات وأيونات ثنائية القطب. دار راينهولد للنشر.