احسب كفاءة PCR من قيم Ct وعوامل التخفيف. تحليل المنحنيات القياسية، تحديد كفاءة التضخيم، والتحقق من تجارب qPCR الكمية الخاصة بك.
يجب أن تكون القيمة إيجابية
يجب أن تكون القيمة إيجابية
يجب أن تكون القيمة إيجابية
يجب أن تكون القيمة إيجابية
يجب أن تكون القيمة إيجابية
أدخل بيانات صحيحة لإنشاء الرسم البياني
كفاءة qPCR هي مقياس لمدى أداء تفاعل PCR. تعني كفاءة 100% أن كمية منتج PCR تتضاعف مع كل دورة خلال المرحلة الأسية.
تُحسب الكفاءة من انحدار المنحنى القياسي، الذي يتم الحصول عليه من خلال رسم قيم Ct مقابل لوغاريتم تركيز القالب الأولي (سلسلة التخفيف).
تُحسب الكفاءة (E) باستخدام الصيغة:
E = 10^(-1/slope) - 1
تعتبر كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) معلمة حاسمة تؤثر مباشرة على دقة وموثوقية تجارب qPCR الخاصة بك. تساعد حاسبة كفاءة qPCR الباحثين في تحديد مدى كفاءة تفاعلات PCR في تضخيم تسلسلات الحمض النووي المستهدفة مع كل دورة حرارية. يجب أن تتراوح كفاءة تفاعلات qPCR المثالية بين 90-110%، مما يشير إلى أن كمية منتج PCR تتضاعف تقريبًا مع كل دورة خلال المرحلة الأسية.
يمكن أن تؤدي كفاءة التضخيم الضعيفة إلى تقديرات غير دقيقة، ونتائج غير موثوقة، واستنتاجات تجريبية معيبة. من خلال حساب ومراقبة كفاءة qPCR الخاصة بك، يمكنك تحسين ظروف التفاعل، والتحقق من تصميم البرايمر، وضمان جودة بيانات PCR الكمية الخاصة بك.
تستخدم هذه الحاسبة طريقة المنحنى القياسي، التي ترسم قيم العتبة الحرارية (Ct) مقابل لوغاريتم تركيز القالب (الممثل بالتخفيفات التسلسلية)، لتحديد كفاءة اختبار qPCR الخاص بك. ثم يتم استخدام الميل الناتج عن هذا المنحنى القياسي لحساب كفاءة التضخيم باستخدام صيغة رياضية بسيطة.
يتم حساب كفاءة تفاعل qPCR من ميل المنحنى القياسي باستخدام الصيغة التالية:
حيث:
بالنسبة لتفاعل PCR المثالي بكفاءة 100% (التضاعف المثالي للمنتجات مع كل دورة)، سيكون الميل -3.32. وذلك لأن:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (أو 100%)}
يتم حساب نسبة الكفاءة عن طريق ضرب الكفاءة العشرية في 100:
\text{الكفاءة (%)} = E \times 100\%
يتم إنشاء المنحنى القياسي من خلال رسم قيم Ct (المحور الصادي) مقابل لوغاريتم التركيز الأولي للقالب أو عامل التخفيف (المحور السيني). يجب أن تكون العلاقة بين هذه المتغيرات خطية، ويتم تقييم جودة هذه العلاقة الخطية باستخدام معامل التحديد (R²).
للحصول على حسابات كفاءة qPCR موثوقة:
إعداد البيانات: تأخذ الحاسبة قيم Ct الخاصة بك لكل نقطة تخفيف وعامل التخفيف كمدخلات.
التحويل اللوغاريتمي: يتم تحويل سلسلة التخفيفات إلى مقياس لوغاريتمي (لوغاريتم الأساس 10).
الانحدار الخطي: تقوم الحاسبة بإجراء تحليل الانحدار الخطي على البيانات المحولة لوغاريتميًا لتحديد الميل، والاعتراض، وقيمة R².
حساب الكفاءة: باستخدام قيمة الميل، يتم حساب الكفاءة باستخدام الصيغة E = 10^(-1/mil) - 1.
تفسير النتائج: تعرض الحاسبة الكفاءة كنسبة مئوية، جنبًا إلى جنب مع الميل وقيمة R² لمساعدتك في تقييم موثوقية اختبار qPCR الخاص بك.
اتبع هذه الخطوات لحساب كفاءة qPCR الخاصة بك:
تحديد عدد التخفيفات: اختر عدد نقاط التخفيف التي لديك في المنحنى القياسي (بين 3-7 نقاط موصى بها).
إدخال عامل التخفيف: أدخل عامل التخفيف المستخدم بين العينات المتتالية (مثل 10 لسلسلة تخفيف 10 أضعاف، 5 لسلسلة تخفيف 5 أضعاف).
إدخال قيم Ct: أدخل قيم Ct لكل نقطة تخفيف. عادةً، تحتوي أول تخفيف (تخفيف 1) على أعلى تركيز للقالب، مما يؤدي إلى أدنى قيمة Ct.
عرض النتائج: ستحسب الحاسبة تلقائيًا وتعرض:
تفسير النتائج: تقييم ما إذا كانت كفاءة qPCR الخاصة بك تقع ضمن النطاق المقبول (90-110%) وما إذا كانت قيمة R² تشير إلى منحنى قياسي موثوق (≥ 0.98).
نسخ النتائج: استخدم زر "نسخ النتائج" لنسخ جميع القيم المحسوبة لسجلاتك أو منشوراتك.
دعنا نمر بمثال:
عند رسمها على منحنى قياسي:
ستقوم الحاسبة بإجراء الانحدار الخطي وتحديد:
باستخدام صيغة الكفاءة:
هذا يشير إلى كفاءة qPCR جيدة تبلغ 93%، والتي تقع ضمن النطاق المقبول من 90-110%.
قبل استخدام زوج برايمر جديد في التجارب الكمية، من الضروري التحقق من أدائه. يساعد حساب كفاءة qPCR في:
عند تطوير اختبارات qPCR جديدة، تعتبر حسابات الكفاءة ضرورية لـ:
في تجارب التقدير النسبي، يعد معرفة كفاءة PCR أمرًا أساسيًا لـ:
في الإعدادات السريرية والتشخيصية، تعتبر كفاءة qPCR مهمة لـ:
بالنسبة لتطبيقات السلامة البيئية والغذائية، تساعد حسابات الكفاءة في:
بينما تعتبر طريقة المنحنى القياسي هي الأكثر شيوعًا لحساب كفاءة qPCR، هناك طرق بديلة:
تقوم هذه الطريقة بحساب الكفاءة من بيانات الفلورية لمنحنى تضخيم فردي، دون الحاجة إلى سلسلة تخفيف. تقوم برامج مثل LinRegPCR بتحليل المرحلة الأسية للتفاعلات الفردية لتحديد الكفاءة.
المزايا:
العيوب:
يوفر PCR الرقمي (dPCR) تقديرًا مطلقًا دون الحاجة إلى منحنى قياسي أو حسابات كفاءة.
المزايا:
العيوب:
تقدم بعض برامج تحليل qPCR طرق تقدير مقارنة تقدر الكفاءة دون الحاجة إلى منحنى قياسي كامل.
المزايا:
العيوب:
تطور مجال qPCR وحسابات الكفاءة بشكل كبير على مدى العقود القليلة الماضية:
تم اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بواسطة كاري موليس في عام 1983، مما أحدث ثورة في علم الأحياء الجزيئي. ومع ذلك، كانت PCR التقليدية نوعًا ما نوعية أو شبه كمية فقط. تم تطوير أول نظام PCR في الوقت الحقيقي في أوائل التسعينيات بواسطة راسل هيغوتشي وزملائه، الذين أظهروا أن مراقبة منتجات PCR أثناء تراكمها (باستخدام فلوريسنت الإيثيديوم) يمكن أن توفر معلومات كمية.
مع تقدم تقنية qPCR، أدرك الباحثون أهمية التوحيد القياسي والتحقق. أصبحت فكرة كفاءة PCR مركزية للتقدير الموثوق:
استمر المجال في التطور مع:
اليوم، يُعتبر حساب والإبلاغ عن كفاءة qPCR أمرًا أساسيًا لنشر بيانات qPCR موثوقة، وتساعد أدوات مثل هذه الحاسبة الباحثين على الالتزام بأفضل الممارسات في هذا المجال.
1' صيغة Excel لحساب كفاءة qPCR من الميل
2' ضع في الخلية B2 إذا كان الميل في الخلية A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' صيغة Excel لتحويل الكفاءة إلى نسبة مئوية
6' ضع في الخلية C2 إذا كانت الكفاءة العشرية في الخلية B2
7=B2*100
8
9' وظيفة لحساب الكفاءة من قيم Ct وعامل التخفيف
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' حساب الانحدار الخطي
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' حساب الميل
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' حساب الكفاءة
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# دالة R لحساب كفاءة qPCR من قيم Ct وعامل التخفيف
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # إنشاء قيم التخفيف اللوغاريتمي
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # إجراء الانحدار الخطي
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # استخراج الميل و R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # حساب الكفاءة
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # إرجاع النتائج
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# مثال على الاستخدام
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("الكفاءة: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("الميل: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-squared: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 حساب كفاءة qPCR من قيم Ct وعامل التخفيف.
8
9 المعلمات:
10 ct_values (list): قائمة بقيم Ct
11 dilution_factor (float): عامل التخفيف بين العينات المتتالية
12
13 العائدات:
14 dict: قاموس يحتوي على الكفاءة، الميل، r_squared، والاعتراض
15 """
16 # إنشاء قيم التخفيف اللوغاريتمي
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # إجراء الانحدار الخطي
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # حساب الكفاءة
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 رسم المنحنى القياسي مع خط الانحدار.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # توليد نقاط لخط الانحدار
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('لوغاريتم التخفيف')
48 plt.ylabel('قيمة Ct')
49 plt.title('المنحنى القياسي لـ qPCR')
50
51 # إضافة المعادلة و R² إلى الرسم
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"الكفاءة = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# مثال على الاستخدام
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"الكفاءة: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"الميل: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-squared: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"الاعتراض: {results['intercept']:.4f}")
73
74# رسم المنحنى القياسي
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * حساب كفاءة qPCR من قيم Ct وعامل التخفيف
3 * @param {Array<number>} ctValues - مصفوفة من قيم Ct
4 * @param {number} dilutionFactor - عامل التخفيف بين العينات المتتالية
5 * @returns {Object} كائن يحتوي على الكفاءة، الميل، rSquared، والاعتراض
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // إنشاء قيم التخفيف اللوغاريتمي
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // حساب المتوسطات للانحدار الخطي
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // حساب الميل والاعتراض
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // حساب R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // حساب الكفاءة
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// مثال على الاستخدام
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`الكفاءة: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`الميل: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-squared: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`الاعتراض: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60تتراوح كفاءة qPCR الجيدة عادةً بين 90% و 110% (0.9-1.1). تمثل كفاءة 100% التضاعف المثالي لمنتج PCR مع كل دورة. يمكن أن تشير الكفاءات خارج هذا النطاق إلى مشاكل في تصميم البرايمر، أو ظروف التفاعل، أو وجود مثبطات.
يمكن أن تحدث الكفاءات التي تزيد عن 100% بسبب:
تشير قيمة R² المنخفضة (أقل من 0.98) إلى ضعف الخطية في منحني القياسي الخاص بك، والتي قد تكون ناجمة عن:
للحصول على حسابات كفاءة موثوقة، مطلوب حد أدنى من 3 نقاط تخفيف، ولكن يُوصى باستخدام 5-6 نقاط للحصول على نتائج أكثر دقة. يجب أن تغطي هذه النقاط النطاق الديناميكي الكامل لتركيزات القالب المتوقعة في عيناتك التجريبية.
في التقدير النسبي باستخدام طريقة ΔΔCt، يُفترض أن تكون الكفاءات متساوية بين الجينات المستهدفة والمرجعية (مثاليًا 100%). عندما تختلف الكفاءات بشكل كبير:
لا، يجب تحديد الكفاءة لكل زوج برايمر ويجب إعادة التحقق منها:
يمكن أن تؤدي المثبطات في PCR إلى:
تستخدم المصطلحات غالبًا بالتبادل، ولكن:
لتحسين كفاءة qPCR:
لا يُوصى بمقارنة العينات ذات الكفاءات المختلفة بشكل كبير لأن:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. إرشادات MIQE: المعلومات الدنيا لنشر تجارب PCR الكمي في الوقت الحقيقي. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. نموذج رياضي جديد للتقدير النسبي في RT-PCR في الوقت الحقيقي. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. ما مدى جودة تقدير كفاءة PCR: توصيات لتقديرات qPCR الدقيقة والموثوقة. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. تجربة qPCR النهائية: إنتاج بيانات قابلة للنشر وقابلة للتكرار من المرة الأولى. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. كفاءة التضخيم: ربط الخط الأساسي والانحياز في تحليل بيانات PCR الكمي. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. تحليل PCR الديناميكي: المراقبة في الوقت الحقيقي لتفاعلات تضخيم الحمض النووي. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. دليل تطبيقات PCR في الوقت الحقيقي. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. دليل PCR في الوقت الحقيقي. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
توفر حاسبة كفاءة qPCR لدينا أداة بسيطة ولكن قوية للباحثين للتحقق من صحة وتحسين تجارب PCR الكمية الخاصة بهم. من خلال حساب الكفاءة بدقة من المنحنيات القياسية، يمكنك ضمان تقدير موثوق، واستكشاف المشاكل في الاختبارات، والالتزام بأفضل الممارسات في تجارب qPCR.
جرب حاسبتنا اليوم لتحسين جودة وموثوقية بيانات qPCR الخاصة بك!
اكتشف المزيد من الأدوات التي قد تكون مفيدة لسير عملك