احسب الأحجام المثلى لتفاعلات ربط الحمض النووي عن طريق إدخال تركيزات المتجه والمُدخل، الأطوال، والنسب المولية. أداة أساسية لعلم الأحياء الجزيئي والهندسة الوراثية.
يعد ربط الحمض النووي تقنية حيوية في علم الأحياء الجزيئي تُستخدم لربط قطع الحمض النووي معًا بواسطة روابط تساهمية. تُعد آلة حاسبة لربط الحمض النووي أداة أساسية للباحثين، حيث تساعد في تحديد الكميات المثلى من الحمض النووي الناقل والحمض النووي المُدخل المطلوبة لتفاعلات الربط الناجحة. من خلال حساب النسب المولارية الصحيحة بين الحمض النووي الناقل (البلازميد) وقطع الحمض النووي المُدخل، تضمن هذه الآلة الحاسبة تجارب استنساخ جزيئي فعالة مع تقليل المواد المهدرة والتفاعلات الفاشلة.
تعتبر تفاعلات الربط أساسية للهندسة الوراثية، وعلم الأحياء الاصطناعي، وإجراءات الاستنساخ الجزيئي. فهي تسمح للعلماء بإنشاء جزيئات الحمض النووي المؤتلف عن طريق إدخال جينات معينة في الناقلات البلازميدية لتحويلها بعد ذلك إلى الكائنات الحية المضيفة. يعتمد نجاح هذه التفاعلات بشكل كبير على استخدام الكميات المناسبة من مكونات الحمض النووي، وهو ما تساعد هذه الآلة الحاسبة في تحديده بدقة.
سواء كنت تقوم بإنشاء ناقلات تعبير، أو إنشاء مكتبات جينية، أو إجراء استنساخ روتيني، ستساعدك آلة حاسبة ربط الحمض النووي هذه في تحسين ظروف تجربتك وزيادة معدل نجاحك. من خلال إدخال بعض المعلمات الرئيسية حول عينات الحمض النووي الخاصة بك، يمكنك بسرعة الحصول على الأحجام الدقيقة المطلوبة لتفاعل الربط المحدد لديك.
تستخدم آلة حاسبة ربط الحمض النووي صيغة أساسية في علم الأحياء الجزيئي تأخذ في الاعتبار الأحجام والتركيزات المختلفة لقطع الحمض النووي التي يتم ربطها. يتم حساب الكمية الأساسية المطلوبة من الحمض النووي المُدخل بالنسبة إلى الحمض النووي الناقل بناءً على أطوالهما والنسبة المولارية المطلوبة.
يتم حساب كمية الحمض النووي المُدخل المطلوبة (بالنانوجرام) باستخدام الصيغة التالية:
حيث:
بمجرد تحديد الكمية المطلوبة من الحمض النووي المُدخل، يتم حساب الأحجام المطلوبة للتفاعل:
دعنا نعمل من خلال مثال عملي:
الخطوة 1: حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
الخطوة 2: حساب الأحجام
يضمن هذا الحساب وجود ثلاث جزيئات مُدخل مقابل كل جزيء ناقل في التفاعل، مما يزيد من فرص الربط الناجح.
تم تصميم آلة حاسبة ربط الحمض النووي لدينا لتكون بديهية وسهلة الاستخدام. اتبع هذه الخطوات لحساب الأحجام المثلى لتفاعل الربط الخاص بك:
أدخل معلومات الناقل:
أدخل معلومات المُدخل:
حدد معلمات التفاعل:
عرض النتائج:
نسخ النتائج (اختياري):
تقوم الآلة الحاسبة بإجراء فحوصات للتحقق من صحة المدخلات لضمان أن جميع المدخلات هي أرقام موجبة وأن الحجم الإجمالي كافٍ للأحجام المطلوبة من الحمض النووي. إذا تم اكتشاف أي أخطاء، ستوجهك رسائل الخطأ المفيدة لتصحيح المدخلات.
تعد آلة حاسبة ربط الحمض النووي قيمة عبر العديد من التطبيقات في علم الأحياء الجزيئي:
تتمثل الحالة الأكثر شيوعًا في الاستنساخ الجزيئي القياسي، حيث يقوم الباحثون بإدخال جينات أو قطع من الحمض النووي في ناقلات بلازميد. تضمن الآلة الحاسبة ظروفًا مثلى لـ:
في علم الأحياء الاصطناعي، حيث يتم تجميع عدة قطع من الحمض النووي غالبًا:
عند تطوير أدوات التشخيص الجزيئي:
للباحثين الذين يعملون على إنتاج البروتين:
في تطبيقات تحرير الجينوم:
تعد الآلة الحاسبة ذات قيمة خاصة في سيناريوهات الربط الصعبة:
بينما توفر آلة حاسبة ربط الحمض النووي لدينا حسابات دقيقة لتفاعلات الربط التقليدية، توجد عدة طرق بديلة لربط قطع الحمض النووي:
تجميع جيبسون: يستخدم إنزيمات إزالة النهايات، والبلمرة، والربط في تفاعل واحد، مما يسمح بربط قطع الحمض النووي المتداخلة. لا يلزم حساب الربط التقليدي، لكن النسب التركيزية لا تزال مهمة.
تجميع غولدن غيت: يستخدم إنزيمات تقييد من النوع IIS للتجميع الاتجاهي، بدون ندبة، لعدة قطع. يتطلب كميات متساوية من جميع القطع.
SLIC (الاستنساخ المستقل عن الربط): يستخدم إنزيمات إزالة النهايات لإنشاء نهايات مفردة تتداخل معًا. عادةً ما يستخدم نسبًا متساوية من القطع.
تجميع In-Fusion: نظام تجاري يسمح بربط القطع مع تداخلات 15 قاعدة. يستخدم نسبة محددة بناءً على أحجام القطع.
تجميع Gateway: يستخدم إعادة التركيب المحددة للموقع بدلاً من الربط. يتطلب ناقلات دخول ووجهة محددة.
الاختبار التجريبي: يفضل بعض المختبرات إعداد تفاعلات ربط متعددة مع نسب مُدخل:ناقل مختلفة (1:1، 3:1، 5:1، 10:1) وتحديد أيها يعمل بشكل أفضل لتركباتهم المحددة.
حاسبات البرمجيات: تتضمن حزم البرمجيات التجارية مثل Vector NTI وSnapGene آلات حاسبة للربط مع ميزات إضافية مثل تحليل مواقع التقييد.
تواكب تطوير حسابات ربط الحمض النووي تطور تقنيات الاستنساخ الجزيئي، التي أحدثت ثورة في علم الأحياء الجزيئي والتكنولوجيا الحيوية.
ظهر مفهوم ربط الحمض النووي للاستنساخ الجزيئي في أوائل السبعينيات مع الأعمال الرائدة لبول بيرغ، وهيربرت بوير، وستانلي كوهين، الذين طوروا أول جزيئات حمض نووي مؤتلف. خلال هذه الفترة، كانت تفاعلات الربط تعتمد إلى حد كبير على التجربة والخطأ، حيث استخدم الباحثون التجربة لتحديد الظروف المثلى.
أدى اكتشاف إنزيمات التقييد وإنزيم الربط إلى توفير الأدوات الأساسية لقص وإعادة ربط جزيئات الحمض النووي. أصبح إنزيم T4 DNA ligase، المعزول من بكتيريا E. coli المصابة بفيروس T4، هو الإنزيم القياسي لربط قطع الحمض النووي بسبب قدرته على ربط النهايات المسطحة والمتماسكة.
مع تحول الاستنساخ الجزيئي إلى إجراء روتيني، بدأ الباحثون في تطوير أساليب أكثر منهجية لتفاعلات الربط. أصبح من الواضح أهمية النسب المولارية بين الحمض النووي الناقل والمُدخل، مما أدى إلى تطوير الصيغة الأساسية المستخدمة حتى اليوم.
خلال هذه الفترة، أسس الباحثون أن استخدام كمية زائدة من الحمض النووي المُدخل (عادةً 3:1 إلى 5:1 نسبة مولارية من المُدخل إلى الناقل) يحسن عمومًا كفاءة الربط لتطبيقات الاستنساخ القياسية. تم تبادل هذه المعرفة في البداية من خلال بروتوكولات المختبر، وشيئًا فشيئًا أصبحت جزءًا من الأدلة والكتب المدرسية في علم الأحياء الجزيئي.
أدى ظهور الأدوات الحاسوبية والآلات الحاسبة عبر الإنترنت في العقد الأول من القرن الحادي والعشرين إلى جعل الحسابات الدقيقة للربط أكثر سهولة للباحثين. مع تطور تقنيات علم الأحياء الجزيئي، أصبحت الحاجة إلى الحسابات الدقيقة أكثر أهمية، خاصة للمشاريع الاستنساخية الصعبة التي تتضمن عدة قطع أو مُدخلات كبيرة.
اليوم، تُعتبر حسابات ربط الحمض النووي جزءًا لا يتجزأ من سير العمل في الاستنساخ الجزيئي، حيث تساعد الآلات الحاسبة المخصصة مثل هذه في تحسين تجارب الباحثين. ظلت الصيغة الأساسية دون تغيير إلى حد كبير، على الرغم من أن فهمنا للعوامل التي تؤثر على كفاءة الربط قد تحسن.
لقد أدت ظهور طرق الاستنساخ البديلة مثل تجميع جيبسون وتجميع غولدن غيت إلى إدخال احتياجات حسابية جديدة، لكن المفهوم الأساسي للنسب المولارية بين قطع الحمض النووي لا يزال مهمًا عبر هذه التقنيات.
إليك تطبيقات آلة حاسبة ربط الحمض النووي بلغات برمجة مختلفة:
1' دالة VBA في Excel لآلة حاسبة ربط الحمض النووي
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3 ' حساب الكمية المطلوبة من المُدخل بالنانوجرام
4 CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8 ' حساب حجم الناقل بالميكرولتر
9 CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13 ' حساب حجم المُدخل بالميكرولتر
14 CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18 ' حساب حجم المحلول/الماء بالميكرولتر
19 CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' مثال على الاستخدام في خلية:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
241def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration,
2 insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3 """
4 حساب الأحجام لتفاعل ربط الحمض النووي.
5
6 المعلمات:
7 vector_concentration (float): تركيز الحمض النووي الناقل بالـ ng/ميكرولتر
8 vector_length (float): طول الحمض النووي الناقل بالقاعدة
9 insert_concentration (float): تركيز الحمض النووي المُدخل بالـ ng/ميكرولتر
10 insert_length (float): طول الحمض النووي المُدخل بالقاعدة
11 molar_ratio (float): النسبة المولارية المطلوبة من المُدخل:الناقل
12 total_volume (float): إجمالي حجم التفاعل بالميكرولتر
13 vector_amount (float): كمية الحمض النووي الناقل لاستخدامها بالـ ng (افتراضي: 50)
14
15 العائدات:
16 dict: قاموس يحتوي على الأحجام والكميات المحسوبة
17 """
18 # حساب حجم الناقل
19 vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20
21 # حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
22 vector_length_kb = vector_length / 1000
23 insert_length_kb = insert_length / 1000
24 insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25
26 # حساب حجم المُدخل
27 insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28
29 # حساب حجم المحلول/الماء
30 buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31
32 return {
33 "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34 "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35 "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36 "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37 "vector_amount": vector_amount
38 }
39
40# مثال على الاستخدام
41result = calculate_ligation_volumes(
42 vector_concentration=50,
43 vector_length=3000,
44 insert_concentration=25,
45 insert_length=1000,
46 molar_ratio=3,
47 total_volume=20
48)
49
50print(f"الناقل: {result['vector_volume']} ميكرولتر ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"المُدخل: {result['insert_volume']} ميكرولتر ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"المحلول: {result['buffer_volume']} ميكرولتر")
53print(f"الإجمالي: 20 ميكرولتر")
541function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration,
2 insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3 // تحويل الأطوال إلى kb للحساب
4 const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5 const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6
7 // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
8 const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9
10 // حساب الأحجام
11 const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12 const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13 const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14
15 return {
16 vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17 insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18 bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19 insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20 vectorAmount: vectorAmount
21 };
22}
23
24// مثال على الاستخدام
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`الناقل: ${result.vectorVolume} ميكرولتر (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`المُدخل: ${result.insertVolume} ميكرولتر (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`المحلول: ${result.bufferVolume} ميكرولتر`);
29console.log(`الإجمالي: 20 ميكرولتر`);
301public class DNALigationCalculator {
2 public static class LigationResult {
3 public final double vectorVolume;
4 public final double insertVolume;
5 public final double bufferVolume;
6 public final double insertAmount;
7 public final double vectorAmount;
8
9 public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume,
10 double insertAmount, double vectorAmount) {
11 this.vectorVolume = vectorVolume;
12 this.insertVolume = insertVolume;
13 this.bufferVolume = bufferVolume;
14 this.insertAmount = insertAmount;
15 this.vectorAmount = vectorAmount;
16 }
17 }
18
19 public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20 double vectorConcentration, double vectorLength,
21 double insertConcentration, double insertLength,
22 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23
24 // تحويل الأطوال إلى kb
25 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27
28 // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
29 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30
31 // حساب الأحجام
32 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35
36 // التقريب إلى منزلتين عشريتين
37 vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38 insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39 bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40 insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41
42 return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43 }
44
45 public static void main(String[] args) {
46 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47
48 System.out.printf("الناقل: %.2f ميكرولتر (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49 System.out.printf("المُدخل: %.2f ميكرولتر (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50 System.out.printf("المحلول: %.2f ميكرولتر%n", result.bufferVolume);
51 System.out.printf("الإجمالي: 20 ميكرولتر%n");
52 }
53}
541#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6 double vectorVolume;
7 double insertVolume;
8 double bufferVolume;
9 double insertAmount;
10 double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14 double vectorConcentration, double vectorLength,
15 double insertConcentration, double insertLength,
16 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17
18 // تحويل الأطوال إلى kb
19 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21
22 // حساب الكمية المطلوبة من المُدخل
23 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24
25 // حساب الأحجام
26 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29
30 // التقريب إلى منزلتين عشريتين
31 vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32 insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33 bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34 insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35
36 return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41
42 std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43 std::cout << "الناقل: " << result.vectorVolume << " ميكرولتر (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44 std::cout << "المُدخل: " << result.insertVolume << " ميكرولتر (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45 std::cout << "المحلول: " << result.bufferVolume << " ميكرولتر" << std::endl;
46 std::cout << "الإجمالي: 20 ميكرولتر" << std::endl;
47
48 return 0;
49}
50تتراوح النسبة المولارية المثلى للمُدخل إلى الناقل عادةً بين 3:1 و 5:1 لتطبيقات الربط القياسية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف هذه النسبة اعتمادًا على السيناريو المحدد للربط:
يمكن أن تؤثر عدة عوامل على كفاءة الربط بخلاف النسبة المولارية:
عادةً ما يُوصى باستخدام 50-100 نانوغرام من الحمض النووي الناقل لتفاعلات الربط القياسية. يمكن أن يؤدي استخدام كمية كبيرة جدًا من الناقل إلى زيادة الخلفية من الناقل غير المقطوع أو الربط الذاتي، بينما قد يقلل القليل جدًا من كفاءة التحويل. قد تحتاج إلى تحسين هذه الكمية لتفاعلات الربط الصعبة.
نعم. تعتبر الربطات بنهايات مسطحة عمومًا أقل كفاءة من الربطات بنهايات متماسكة. بالنسبة للربط بنهايات مسطحة، استخدم:
لتجميع عدة قطع:
تم تصميم هذه الآلة الحاسبة خصيصًا لتفاعلات الربط التقليدية باستخدام إنزيمات التقييد والربط. لتجميع جيبسون، عادةً ما يُوصى بكميات متساوية من جميع القطع (نسبة 1:1)، على الرغم من أن الحساب الأساسي لكمية الحمض النووي بناءً على الطول مشابه. بالنسبة لتجميع غولدن غيت، تُستخدم أيضًا نسب متساوية من جميع المكونات.
لا تؤثر إزالة الفوسفات من الناقل (إزالة مجموعات الفوسفات 5') على حسابات الكمية، ولكن بالنسبة للناقلات التي تم إزالة الفوسفات منها:
عادةً ما يكون الحد الأدنى لحجم التفاعل العملي حوالي 10 ميكرولتر، مما يسمح بخلط كافٍ ويمنع مشاكل التبخر. إذا تجاوزت الأحجام المحسوبة من الحمض النووي الحجم المطلوب، لديك عدة خيارات:
تختلف أوقات الحضانة المثلى بناءً على نوع الربط:
نعم، يمكن عادةً تخزين خلطات الربط عند -20 درجة مئوية وإعادة استخدامها للتحويل. ومع ذلك، قد تقلل كل دورة تجميد-ذوبان من الكفاءة. للحصول على أفضل النتائج:
سامبروك ج، راسل د. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر (الطبعة الثالثة). مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور.
غرين م. ر، سامبروك ج. (2012). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر (الطبعة الرابعة). مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور.
إنجلر ج، كاندزيا ر، ماريونيت س. (2008). طريقة تجميع دقيقة، خطوة واحدة، مع قدرة عالية على الإنتاج. PLoS ONE، 3(11)، e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
جيبسون د. ج، يونغ ل، تشوانغ ر. ي، فينتر ج. س، هوتشيسون ج. أ، سميث ه. أ. (2009). التجميع الإنزيمي لجزيئات الحمض النووي حتى عدة مئات من الكيلوباز. طرق الطبيعة، 6(5)، 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
أسلانيديس ج، دي جونغ ب. ج. (1990). الاستنساخ المستقل عن الربط لمنتجات PCR (LIC-PCR). أبحاث الأحماض النووية، 18(20)، 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
زيمرمان س. ب، فيفير ب. ه. (1983). يسمح الازدحام الجزيئي بالربط بنهايات مسطحة بواسطة إنزيمات الربط من كبد الجرذ أو الإشريكية القولونية. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، 80(19)، 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - مرجع علم الأحياء الجزيئي. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
نيو إنجلاند بيولوجي (NEB) - بروتوكول الربط الحمضي النووي. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
ثيرمو فيشر العلمية - مرجع تقني للاستنساخ الجزيئي. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
بروميجا - دليل تقني للاستنساخ. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/
اكتشف المزيد من الأدوات التي قد تكون مفيدة لسير عملك