حاسبة ربط الحمض النووي - حساب نسب الإدراج والمتجه للتكاثر الجزيئي

ربط DNA هو الخطوة في الاستنساخ الجزيئي التي تُربط فيها قطعة الإدخال بناقل بلازميدي بواسطة إنزيم ليغاز DNA ‏T4. تحسب حاسبة ربط DNA عدد الميكرولترات من DNA الإدخال وDNA الناقل اللذين ينبغي مزجهما لكي يصل التفاعل إلى نسبة مولارية محددة من الإدخال إلى الناقل.

ما الذي يفعله الحاسِب

تتطلب الحاسبة ستة مدخلات: تركيز الناقل، وطول الناقل، وتركيز الإدخال، وطول الإدخال، والنسبة المولارية المستهدفة من الإدخال إلى الناقل، والحجم الكلي للتفاعل. كما تتيح للمستخدم تحديد كمية DNA الناقل المستخدمة، والتي تكون افتراضيًا 50 نانوغرام (ng). وتحسب من هذه القيم حجم الناقل المراد سحبه بالماصة، وحجم الإدخال المراد سحبه بالماصة، وكمية المحلول المنظِّم أو الماء اللازمين إضافتهما للوصول إلى الحجم الكلي للتفاعل.

يُقاس التركيز بالنانوغرام لكل ميكرولتر (ng/μL)، ويُقرأ عادةً من جهاز Nanodrop أو Qubit. ويُقاس الطول بأزواج القواعد (bp). يعادل الكيلوقاعدة الواحدة (kb) 1000 زوجًا قاعديًا. وتصف النسبة المولارية عدد جزيئات الإدخال التي ينبغي أن توجد مقابل كل جزيء ناقل واحد. وهي ليست نسبة كتلة.

لماذا تُستخدم النسبة المولارية بدلًا من الكتلة

لا تحتوي الكتل المتساوية من DNA على أعداد متساوية من الجزيئات. تزن قطعة إدخال قصيرة أقل من ناقل طويل له العدد نفسه من الجزيئات. وسيؤدي مزج كميتين متساويتين بالنانوغرام من إدخال قصير وناقل طويل إلى وجود عدد قليل جدًا من جزيئات الإدخال مقارنةً بجزيئات الناقل. وتضبط الحاسبة كتلة الإدخال وفق نسبة أطوال القطع، بحيث يحتوي المزيج النهائي على العدد المقصود من جزيئات الإدخال لكل جزيء ناقل.

معادلة ربط DNA

كمية DNA الإدخال المطلوبة، بالنانوغرام، هي:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

حيث إن $m_i$ تمثل كمية القطعة المُدخلة بالنانوغرام، و$m_v$ كمية الناقل بالنانوغرام، و$k_i$ طول القطعة المُدخلة بالكيلو قاعدة، و$k_v$ طول الناقل بالكيلو قاعدة، وتمثل R النسبة المولية المستهدفة للقطعة المُدخلة إلى الناقل.

بعد معرفة هذه الكمية، تحوّل الحاسبة كل كمية إلى حجم مناسب للسحب بالماصة:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

حيث إن $V_v$ و$V_i$ يمثلان حجمي الناقل والقطعة المُدخلة بالميكرولتر، و$c_v$ و$c_i$ يمثلان تركيزي الناقل والقطعة المُدخلة بالنانوغرام لكل ميكرولتر، و$V_b$ يمثل حجم المحلول المنظّم، و$V_t$ حجم التفاعل الكلي.

إذا تجاوز مجموع حجمي الناقل والإدخال الحجم الكلي للتفاعل، فلن يتبقى مكان للمحلول المنظِّم أو إنزيم الربط أو الماء. وفي هذه الحالة تُبلغ الحاسبة بأن الحجم الكلي صغير جدًا، بدلًا من عرض كمية سالبة للمحلول المنظِّم.

مثال محلول

يُجري باحث استنساخ قطعة جينية طولها 1 kb داخل ناقل بلازميدي طوله 3 kb. وتتمثل الخطة في استخدام 50 ng من DNA الناقل بنسبة مولارية للإدخال إلى الناقل قدرها 3:1، ضمن تفاعل حجمه 20 μL.

المدخلات:

• تركيز الناقل: 50 ng لكل ميكرولتر
• طول الناقل: 3000 زوج قاعدة (3 kb)
• تركيز الإدخال: 25 ng لكل ميكرولتر
• طول الإدخال: 1000 زوج قاعدة (1 kb)
• النسبة المولارية: 3
• الحجم الكلي: 20 μL
• كمية الناقل: 50 ng

الخطوة 1: كمية الإدخال

نانوغرامات الإدخال = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

الخطوة 2: الأحجام

حجم الناقل = 50 ng ÷ 50 ng/ميكرولتر = 1 μL

حجم الإدخال = 50 ng ÷ 25 ng/ميكرولتر = 2 μL

حجم المحلول المنظِّم = 20 − 1 − 2 = 17 μL

يتكون التفاعل من 1 μL من الناقل، و2 μL من الإدخال، و17 μL من المحلول المنظِّم أو الماء، حيث يُضاف أيضًا إنزيم الربط ومحلوله المنظِّم الخاص بالتفاعل. ويعطي هذا المزيج ثلاثة جزيئات إدخال لكل جزيء ناقل.

النسب المولارية المعتادة لربط DNA

تستخدم معظم عمليات الاستنساخ القياسية ذات النهايات اللاصقة البارزة نسبةً موليةً قدرها 3:1 للإدخال إلى الناقل. ويكون ربط النهايات المستقيمة أقل كفاءة، لذلك تُستخدم عادةً نسبة أعلى مثل 5:1. وأحيانًا تعمل الإدخالات الكبيرة جدًا بصورة أفضل مع نسبة أقل، أقرب إلى 1:1، لأن القطع الكبيرة تساهم أصلًا بعدد كبير من أزواج القواعد لكل جزيء.

الأسئلة الشائعة

ما هو ربط DNA؟

ربط DNA هو وصل قطعتين من DNA، عادةً ناقل بلازميدي وإدخال، في جزيء واحد متصل. ويغلق إنزيم ليغاز DNA ‏T4 الوصلة بين نهايتي القطعتين.

ماذا تعني النسبة المولارية للإدخال إلى الناقل؟

هي عدد جزيئات DNA الإدخال الموجودة مقابل كل جزيء ناقل واحد في التفاعل. وتعني نسبة 3:1 وجود ثلاثة جزيئات إدخال لكل جزيء ناقل، بصرف النظر عن مقارنة كتلتيهما.

لماذا لا تُستخدم كميات متساوية بالنانوغرام من الناقل والإدخال؟

تختلف كتلة قطع DNA لكل جزيء باختلاف أطوالها. ويزن إدخال طوله 1 kb نحو ثلث وزن ناقل طوله 3 kb، عند مقارنة الجزيئات واحدًا بواحد. ولن تعطي الكميات المتساوية بالنانوغرام أعدادًا متساوية من الجزيئات، لذلك تضبط الحاسبة كتلة الإدخال لتوافق النسبة المولارية المستهدفة.

ماذا يعني أن الحجم الكلي صغير جدًا؟

يعني ذلك أن حجمي الناقل والإدخال وحدهما يستهلكان كامل حجم التفاعل، فلا يتبقى مكان للمحلول المنظِّم أو إنزيم الربط. والحل هو زيادة الحجم الكلي للتفاعل أو استخدام محاليل DNA أكثر تركيزًا.

هل يمكن استخدام هذه الحاسبة لاستنساخ Gibson Assembly أو Golden Gate؟

لا. تستخدم هاتان الطريقتان كيمياء تفاعل مختلفة، وتستهدفان عادةً كميات متساوية مولاريًا من جميع القطع بدلًا من نسبة ثابتة بين الإدخال والناقل. وتختلف حسابات الأحجام فيهما عن الاستنساخ القياسي باستخدام إنزيم ربط T4.

ما كمية DNA الناقل المستخدمة عادةً؟

تُعد كمية 50 ng نقطة بداية شائعة لتفاعل ربط قياسي. كما تستخدم المختبرات كميات تتراوح من 25 إلى 100 ng، مع ضبطها وفق تركيز DNA وحجم التفاعل.