حاسبة تركيز الحمض النووي | محول A260 إلى نانوغرام/ميكرولتر

حاسبة تركيز الحمض النووي DNA

تحوّل حاسبة تركيز الحمض النووي قراءة الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر، التي تُسمّى A260، إلى تركيز الحمض النووي بوحدة نانوغرام لكل ميكرولتر (ng/µL). كما تعرض الكمية الإجمالية للحمض النووي في العينة بوحدة ميكروغرام (µg).

ما امتصاصية A260؟

تمثل A260 كمية الضوء فوق البنفسجي التي يمتصها المحلول عند طول موجي قدره 260 نانومتر. يمتص الحمض النووي الضوء فوق البنفسجي بأعلى قدر بالقرب من هذا الطول الموجي بسبب قواعده النوكليوتيدية. يقيس مقياس الطيف الضوئي A260 بعد إجراء قراءة الشاهد، باستخدام المحلول المنظّم نفسه المستخدم للعينة، لإزالة امتصاصية الخلفية. وكلما زادت كمية الحمض النووي في المحلول، ارتفعت قراءة A260.

معادلة تركيز الحمض النووي

يمتص الحمض النووي مزدوج السلسلة الضوء فوق البنفسجي بما يتناسب مع تركيزه، وهي علاقة تُعرف بقانون بير-لامبرت. في مسار ضوئي قياسي طوله 1 سنتيمتر، يحتوي محلول ذو قراءة A260 قدرها 1.0 على نحو 50 ng/µL من الحمض النووي مزدوج السلسلة. يحوّل هذا الرقم، وهو عامل التحويل، أي قراءة A260 إلى تركيز:

تركيز الحمض النووي (ng/µL) = A260 × 50 × عامل التخفيف

يأخذ عامل التخفيف في الحسبان أي تخفيف أُجري قبل قياس العينة. وتكون قيمة عامل التخفيف للعينة التي قِيست من دون تخفيف 1.

كيفية حساب المحصول الكلي للحمض النووي

بعد معرفة التركيز، يمكن تحديد الكتلة الكلية للحمض النووي في العينة من حجمها:

الحمض النووي الكلي (µg) = التركيز (ng/µL) × الحجم (µL) ÷ 1000

كيفية حساب تركيز الحمض النووي: خطوة بخطوة

1. اخلط العينة جيدًا قبل القياس. فقد يلتصق الحمض النووي بجدران الأنبوب أو يترسب بشكل غير متجانس.
2. خفّف العينة إذا كان تركيزها مرتفعًا جدًا، مستهدفًا قراءة A260 بين 0.1 و1.0. وتكون قراءات مقياس الطيف الضوئي الأقل موثوقية خارج هذا النطاق.
3. صفّر مقياس الطيف الضوئي باستخدام المحلول المنظّم نفسه المستخدم للتخفيف، ثم قِس العينة عند 260 نانومتر.
4. أدخل قراءة A260 وحجم العينة وعامل التخفيف في الحاسبة للحصول على التركيز والمحصول الكلي. يجب ملء الخانات الثلاث جميعها، كما يجب أن يكون الحجم أكبر من الصفر، قبل ظهور النتيجة.

مثال محلول

المثال 1: عينة غير مخففة

قراءة A260 قدرها 0.5، من دون تخفيف (عامل التخفيف 1)، وحجم العينة 100 µL.

• التركيز = 0.5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• الحمض النووي الكلي = 25 × 100 ÷ 1000 = 2.5 µg

المثال 2: عينة مخففة

يحتوي أنبوب على 50 µL من الحمض النووي المنقّى. خُفّفت كمية صغيرة منه بمقدار 10 مرات، وأعطت الكمية المخففة قراءة A260 قدرها 0.75. يحوّل عامل التخفيف تلك القراءة مرة أخرى إلى التركيز في الأنبوب الأصلي، ويُدخل الحجم 50 µL في خطوة حساب المحصول الكلي.

• التركيز = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• الحمض النووي الكلي = 375 × 50 ÷ 1000 = 18.75 µg

حساب عامل التخفيف

عامل التخفيف = الحجم الكلي بعد التخفيف ÷ حجم العينة الأصلية.

تؤدي إضافة 5 µL من محلول الحمض النووي إلى 45 µL من المحلول المنظّم إلى حجم كلي قدره 50 µL، ولذلك يكون عامل التخفيف 50 ÷ 5 = 10. وتكون قيمة عامل التخفيف للعينة التي لم تُخفّف 1.

نطاقات تركيز الحمض النووي المعتادة

يعتمد التركيز على نوع العينة وطريقة الاستخلاص. وعادةً ما تتراوح استخلاصات الحمض النووي الجينومي بين نحو 10 و100 ng/µL. وغالبًا ما تعطي مستحضرات الحمض النووي البلازميدي تراكيز أعلى، قد تبلغ أحيانًا عدة مئات من ng/µL. وقد تشير نتيجة بعيدة كثيرًا عن النطاق المتوقع لطريقة معينة إلى مشكلة في الاستخلاص أو في القياس نفسه.

حدود قياس الامتصاصية بالأشعة فوق البنفسجية

قياس A260 سريع، لكنه ليس الطريقة الأكثر حساسية أو نوعية لقياس الحمض النووي. فالبروتينات والحمض النووي الريبي وبعض مكونات المحلول المنظّم تمتص الضوء أيضًا بالقرب من 260 نانومتر، وقد ترفع القراءة. وغالبًا ما يفحص العلماء نسبة A260/A280 إلى جانب التركيز للكشف الأولي عن تلوث البروتين؛ وتشير النسبة القريبة من 1.8 عادةً إلى عينة حمض نووي نقي. أما الطرق المعتمدة على الأصبغة الفلورية، مثل اختبارات Qubit، فترتبط بالحمض النووي مزدوج السلسلة فقط وتعطي قراءة أدق للعينات المخففة أو غير النقية، لكنها تتطلب كواشف إضافية ومقياس فلورية.

الأسئلة الشائعة

كيف تحسب تركيز الحمض النووي من A260؟

اضرب قراءة A260 في 50، وهو عامل التحويل القياسي للحمض النووي مزدوج السلسلة، ثم اضرب الناتج في عامل التخفيف. وإذا لم تُخفّف العينة، فاستخدم عامل تخفيف قدره 1.

ما النسبة الجيدة لـ A260/A280؟

تشير النسبة القريبة من 1.8 عادةً إلى عينة حمض نووي نقي. وتشير النسبة الأقل إلى تلوث بالبروتين. وقد تشير النسبة الأعلى من 2.0 إلى تلوث بالحمض النووي الريبي.

هل يمكن استخدام هذه الحاسبة للحمض النووي الريبي؟

ليس مباشرةً، لأن الحمض النووي الريبي يستخدم عامل تحويل قدره 40 ng/µL بدلًا من 50. ولتقدير تركيز الحمض النووي الريبي، اضرب نتيجة الحاسبة في 0.8 (40 ÷ 50)، أو استخدم A260 × 40 × عامل التخفيف مباشرةً.

لماذا ينبغي أن تقع قراءة A260 بين 0.1 و1.0؟

تظل الامتصاصية متناسبة تقريبًا مع التركيز، وفقًا لما يصفه قانون بير-لامبرت، ضمن هذا النطاق أساسًا. وخارجه تصبح القراءات أقل موثوقية، ولذلك ينبغي تخفيف العينة شديدة التركيز أو تركيز العينة شديدة التخفيف قبل إعادة القياس.

ما الفرق بين التركيز والنقاوة؟

يقيس التركيز كمية الحمض النووي الموجودة بوحدة ng/µL. أما النقاوة فتقيس مدى نظافة العينة، ويُحكم عليها أساسًا من نسب الامتصاصية مثل A260/A280. وقد تكون للعينة قيمة تركيز مرتفعة مع بقائها غير نقية، أو قيمة تركيز منخفضة مع كونها عالية النقاوة.

كيف أحوّل ng/µL إلى µg/mL؟

الوحدتان متساويتان عدديًا. فـ 1 ng/µL تساوي 1 µg/mL، لأن وحدة الكتلة ووحدة الحجم تتغير كل منهما بعامل قدره 1000.

المراجع

1. سامبروك، ج.، وراسل، د. و. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبري (الطبعة 3). مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور.
2. غالاغر، س. ر.، وديجاردان، ب. ر. (2006). تقدير كمية الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام مطيافية الامتصاص والفلورية. البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئي، 76(1)، A-3D.
3. مانشستر، ك. ل. (1995). قيمة نسب A260/A280 لقياس نقاوة الأحماض النووية. BioTechniques، 19(2)، 208–210.