احسب تركيز الحمض النووي من قراءات الامتصاص (A260) مع عوامل تخفيف قابلة للتعديل. أداة أساسية لمختبرات البيولوجيا الجزيئية والبحوث الجينية.
يتم حساب تركيز الحمض النووي باستخدام المعادلة التالية:
آلة حساب تركيز الحمض النووي هي أداة أساسية عبر الإنترنت تساعد علماء الأحياء الجزيئية وعلماء الوراثة وفنيي المختبرات على تحديد تركيز الحمض النووي بدقة من قراءات الطيف الضوئي. تستخدم هذه الآلة المجانية طريقة A260 القياسية لتحويل قياسات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية إلى قيم دقيقة لتركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر.
يعد قياس تركيز الحمض النووي إجراءً أساسيًا في مختبرات الأحياء الجزيئية، حيث يعمل كخطوة حاسمة لمراقبة الجودة قبل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) والتسلسل والاستنساخ وتقنيات جزيئية أخرى. تقضي الآلة لدينا على الحسابات اليدوية وتقلل من الأخطاء عند تحديد كل من التركيز والمجموع الكلي للحمض النووي في عيناتك.
يعتمد حساب تركيز الحمض النووي على قانون بير-لامبرت، الذي ينص على أن امتصاص محلول ما يتناسب طرديًا مع تركيز الأنواع الممتصة في المحلول وطول مسار الضوء عبر المحلول. بالنسبة للحمض النووي مزدوج الشريطة، فإن امتصاصًا قدره 1.0 عند 260 نانومتر (A260) في قنينة بطول مسار 1 سم يتوافق مع تركيز يقارب 50 نانوغرام/ميكرولتر.
يتم حساب تركيز الحمض النووي باستخدام المعادلة التالية:
حيث:
يمكن بعد ذلك حساب المجموع الكلي للحمض النووي في العينة بواسطة:
الامتصاص عند 260 نانومتر (A260):
عامل التحويل (50):
عامل التخفيف:
الحجم:
اتبع هذه العملية البسيطة لـ حساب تركيز الحمض النووي من قراءات A260 الخاصة بك:
يعد قياس تركيز الحمض النووي أمرًا أساسيًا للعديد من التطبيقات في الأحياء الجزيئية والبحث:
قبل ربط قطع الحمض النووي في الناقلات، يسمح معرفة التركيز الدقيق للباحثين بحساب نسبة الإدخال إلى الناقل المثلى، مما يزيد من كفاءة التحول. على سبيل المثال، غالبًا ما يؤدي نسبة 3:1 من الإدخال إلى الناقل إلى أفضل النتائج، مما يتطلب قياسات دقيقة لتركيز كلا المكونين.
تتطلب تفاعلات PCR عادةً 1-10 نانوغرام من الحمض النووي القالب لتحقيق تضخيم مثالي. قد يؤدي نقص الحمض النووي إلى فشل التضخيم، بينما يمكن أن يؤدي الكثير منه إلى تثبيط التفاعل. بالنسبة لـ PCR الكمي (qPCR)، تكون الحاجة إلى قياس الحمض النووي بدقة أكبر ضرورية لضمان دقة المنحنيات القياسية وموثوقية القياس.
تحدد بروتوكولات إعداد مكتبة NGS كميات إدخال الحمض النووي الدقيقة، وغالبًا ما تكون في نطاق 1-500 نانوغرام اعتمادًا على المنصة والتطبيق. يعد قياس التركيز بدقة أمرًا أساسيًا لإعداد المكتبة الناجحة وتمثيل العينات بشكل متوازن في عمليات التسلسل المتعددة.
عند إدخال الحمض النووي في خلايا حقيقية النواة، يختلف مقدار الحمض النووي المثالي حسب نوع الخلية وطريقة النقل. عادةً ما يتم استخدام 0.5-5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي لكل بئر في تنسيق 6 آبار، مما يتطلب قياس تركيز دقيق لتوحيد التجارب.
في التطبيقات الجنائية، غالبًا ما تكون عينات الحمض النووي محدودة وثمينة. يسمح القياس الدقيق للعلماء الجنائيين بتحديد ما إذا كان هناك ما يكفي من الحمض النووي للملف الشخصي وتوحيد كمية الحمض النووي المستخدمة في التحليلات اللاحقة.
تمتلك إنزيمات التقييد وحدات نشاط محددة لكل ميكروغرام من الحمض النووي. يسمح معرفة التركيز الدقيق للحمض النووي بالحصول على نسب صحيحة من الإنزيم إلى الحمض النووي، مما يضمن هضمًا كاملاً دون نشاط غير محدد (قطع غير محدد).
بينما يعد قياس الطيف فوق البنفسجي الطريقة الأكثر شيوعًا لتحديد تركيز الحمض النووي، توجد عدة بدائل:
طرق الفلورية:
الرحلان الكهربائي في الهلام الأجاروزي:
PCR في الوقت الحقيقي:
PCR الرقمية:
تطورت القدرة على قياس تركيز الحمض النووي بدقة بشكل كبير بالتوازي مع التقدم في علم الأحياء الجزيئية:
بعد اكتشاف هيكل الحمض النووي بواسطة واتسون وكريك في عام 1953، بدأ العلماء في تطوير طرق لعزل وقياس الحمض النووي. اعتمدت الأساليب المبكرة على اختبارات لونية مثل تفاعل ثنائي الفينيل أمين، الذي أنتج لونًا أزرق عند تفاعله مع السكريات المنقوصة الأكسجين في الحمض النووي. كانت هذه الطرق حساسة نسبيًا وعرضة للتداخل.
أصبح تطبيق قياس الطيف فوق البنفسجي على قياس الأحماض النووية شائعًا في السبعينيات. اكتشف العلماء أن الحمض النووي يمتص الضوء فوق البنفسجي بأقصى حد عند 260 نانومتر، وأن العلاقة بين الامتصاص والتركيز كانت خطية ضمن نطاق معين. تم تحديد عامل التحويل البالغ 50 نانوغرام/ميكرولتر للحمض النووي مزدوج الشريطة عند A260 = 1.0 خلال هذه الفترة.
أدى تطوير الأصباغ الفلورية الخاصة بالحمض النووي في الثمانينيات والتسعينيات إلى ثورة في قياس الحمض النووي، خاصة للعينات المخففة. مكنت أصباغ هوشت وPicoGreen من الكشف عن كميات أكثر حساسية مما كان ممكنًا مع القياس الطيفي. أصبحت هذه الطرق مهمة بشكل خاص مع ظهور PCR، الذي غالبًا ما يتطلب قياسًا دقيقًا لكميات دقيقة من الحمض النووي.
أدى إدخال مطياف الضوء المجهري مثل NanoDrop في أوائل العقد الأول من القرن 21 إلى تحويل قياس الحمض النووي الروتيني من خلال الحاجة إلى 0.5-2 ميكرولتر فقط من العينة. ألغت هذه التكنولوجيا الحاجة إلى التخفيفات والقناني، مما جعل العملية أسرع وأكثر ملاءمة.
اليوم، دفعت التقنيات المتقدمة مثل PCR الرقمية والتسلسل من الجيل التالي حدود قياس الحمض النووي إلى أبعد من ذلك، مما يسمح بالقياس المطلق للتسلسلات المحددة والكشف عن الجزيئات الفردية. ومع ذلك، فإن المبدأ الطيفي الأساسي الذي تم تأسيسه قبل عقود لا يزال العمود الفقري لقياس تركيز الحمض النووي الروتيني في المختبرات في جميع أنحاء العالم.
دعونا نستعرض بعض الأمثلة العملية لحسابات تركيز الحمض النووي:
لدى باحث بلازميد تم تنقيته وحصل على القياسات التالية:
الحساب:
بعد استخراج الحمض النووي الجينومي من الدم:
الحساب:
يتطلب بروتوكول التسلسل 500 نانوغرام بالضبط من الحمض النووي:
الحجم المطلوب = 500 ÷ 125 = 4 ميكرولتر من محلول الحمض النووي
إليك أمثلة على كيفية حساب تركيز الحمض النووي في لغات برمجة مختلفة:
1' صيغة Excel لحساب تركيز الحمض النووي
2=A260*50*عامل_التخفيف
3
4' صيغة Excel لحساب إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
5=(A260*50*عامل_التخفيف*الحجم)/1000
6
7' مثال في خلية مع A260=0.5، عامل_التخفيف=2، الحجم=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' النتيجة: 5 ميكروغرام
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 حساب تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
4
5 المعلمات:
6 absorbance (float): قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر
7
8 العائدات:
9 float: تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
10 """
11 return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14 """
15 حساب إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
16
17 المعلمات:
18 concentration (float): تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر
19 volume_ul (float): حجم محلول الحمض النووي بالميكروتر
20
21 العائدات:
22 float: إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام
23 """
24 return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# مثال للاستخدام
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"تركيز الحمض النووي: {concentration:.2f} نانوغرام/ميكرولتر")
35print(f"إجمالي الحمض النووي: {total_dna:.2f} ميكروغرام")
36function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) { // تعيد تركيز الحمض النووي بالنانوغرام/ميكرولتر return absorbance * 50 * dilutionFactor; } function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) { // تعيد إجمالي كمية الحمض النووي بالميكروغرام return (concentration * volumeUL) / 1000; } // مثال للاستخدام const absorbance = 0.65; const dilutionFactor = 2; const volume = 100; const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
اكتشف المزيد من الأدوات التي قد تكون مفيدة لسير عملك