Калкулатор за концентрация на протеини | A280 до mg/mL

Калкулатор за концентрация на протеин

Калкулаторът за концентрация на протеин преобразува показанието за поглъщане на светлина от спектрофотометър в количеството протеин, разтворен в разтвор. Резултатът обикновено се дава в милиграми на милилитър (mg/mL) или микрограми на милилитър (μg/mL). Изчислението се основава на закона на Беер–Ламберт — зависимост в химията, която свързва количеството погълната от пробата светлина с количеството вещество, което тя съдържа.

Как се измерва концентрацията на протеин

Повечето протеини поглъщат силно ултравиолетова светлина с дължина на вълната 280 нанометра (nm). Това поглъщане се дължи главно на две аминокиселини — триптофан и тирозин, които се съдържат в структурата на протеина. Спектрофотометърът пропуска светлина през пробата и измерва каква част от нея се поглъща от пробата. Това показание се нарича абсорбция или A280, когато е получено при 280 nm.

Измерването на абсорбцията при 280 nm е бързо и не унищожава пробата. Това го отличава от химични методи като анализа на Брадфорд или анализа с BCA, описани по-долу. Методът работи най-добре с пречистен протеин в разтвор и показание за абсорбция между приблизително 0,1 и 1,0. Показанията извън този диапазон са по-малко надеждни, затова пробата често трябва да се разреди преди измерването.

Формула за концентрация на протеин

Калкулаторът преобразува закона на Беер–Ламберт, за да изчисли концентрацията:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — концентрация на протеина в mg/mL
• A — абсорбция при 280 nm (безразмерно число)
• DF — коефициент на разреждане, показващ колко пъти първоначалната проба е била разредена преди измерването
• ε — коефициент на екстинкция, специфичен за протеина, в L/(g·cm)
• l — дължина на оптичния път, разстоянието, което светлината изминава през пробата, в cm (обикновено 1 cm в стандартна кювета — малък стъклен или пластмасов съд, използван в спектрофотометъра)

За да преобразувате резултата в микрограми на милилитър, умножете стойността в mg/mL по 1 000. За да намерите общата маса на протеина в пробата, умножете концентрацията по обема на пробата в милилитри.

Пример с решение

Проба дава показание за абсорбция 0,5 при 280 nm. Тя не е била разреждана, така че коефициентът на разреждане е 1, а измерването е извършено в стандартна кювета с размер 1 cm. Протеинът е серумен албумин от говедо (BSA), който има коефициент на екстинкция 0,667 l/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 мг/mL

В проба от 1 ml това е приблизително 0,75 мг общ протеин, или 750 мкг/mL.

Коефициенти на екстинкция за често срещани протеини

Всеки протеин поглъща светлината по различен начин, тъй като съдържа различен брой остатъци на триптофан и тирозин. Коефициентът на екстинкция описва това свойство за конкретен протеин при дължина на вълната 280 nm, в единици L/(g·cm). Често използваните стойности включват:

Калкулаторът може да използва и персонализиран коефициент на екстинкция за протеин, който не е в този списък. За протеин с известна аминокиселинна последователност тази стойност може да се изчисли с формула, публикувана от Gill и von Hippel през 1989 г.: ε₂₈₀ = (остатъци на триптофан × 5 500) + (остатъци на тирозин × 1 490) + (остатъци на цистин × 125). Формулата дава резултат в M⁻¹cm⁻¹ — моларна единица, която се различава от посочените по-горе стойности на масова основа в L/(g·cm). Безплатни инструменти като ProtParam, хоствани от сървъра ExPASy, изчисляват тази стойност директно от протеинова последователност.

Дължина на оптичния път и коефициент на разреждане

Дължината на оптичния път е ширината на кюветата, в която се намира пробата, измерена в сантиметри. Стандартните кювети са широки 1 cm. Спектрофотометрите за малки обеми, които измерват много малки проби, може да използват значително по-къс оптичен път, например 0,1 cm.

Коефициентът на разреждане отчита всяко разреждане, извършено преди измерването. Ако концентрирана проба би дала абсорбция над 1,0, обичайно първо се разрежда с буфер. Коефициентът на разреждане е равен на общия обем след разреждането, разделен на първоначалния обем на пробата. Например смесването на 10 мкл проба с 990 мкл буфер дава общ обем 1 000 мкл и коефициент на разреждане 100.

Други начини за измерване на концентрацията на протеин

Абсорбцията при 280 nm е един от няколкото често използвани лабораторни метода.

• Анализ на Брадфорд: използва багрило, което променя цвета си, когато се свърже с протеин. Работи добре с непречистени проби, но промяната на цвета може да се различава при различните протеини.
• Анализ с BCA: основава се на промяна на цвета, причинена от пептидните връзки на протеина. Съвместим е с много детергенти, но изисква повече време от директното измерване на абсорбцията.
• Метод на Лоури: по-стар метод, който е много чувствителен, но реагира неблагоприятно с някои често използвани съставки на буферите.

Всеки от тези три метода унищожава пробата. Директното измерване на A280 не я унищожава, така че същата проба може да бъде възстановена и използвана отново.

Често задавани въпроси

Какъв е идеалният диапазон на абсорбция за този метод?

Между 0,1 и 1,0. Под 0,1 показанието е неточно. Над 1,0 зависимостта между абсорбцията и концентрацията може вече да не е линейна, затова пробата първо трябва да се разреди.

Защо се измерва при 280 nm вместо при 260 nm?

Нуклеиновите киселини, като ДНК и РНК, поглъщат силно при 260 nm. Протеините поглъщат повече при 280 nm поради съдържанието си на триптофан и тирозин. Измерването при 280 nm намалява влиянието на нуклеиновите киселини, които може да присъстват в пробата.

Как се определя коефициентът на екстинкция за протеин, който не е в списъка?

За протеин с известна последователност инструмент като ProtParam го изчислява въз основа на броя остатъци на триптофан, тирозин и цистин. Той може да бъде измерен и директно чрез сравняване на абсорбцията на пробата с тази на разтвор с известна концентрация.

Работи ли този метод за смес от протеини?

Работи най-добре с един пречистен протеин, за който е известен коефициентът на екстинкция. Смес от неизвестни протеини, например клетъчен лизат, обикновено се измерва с анализа на Брадфорд или с анализа с BCA, тъй като тези методи дават по-последователна оценка на общото количество протеин.

Могат ли детергентите да повлияят на показанието?

Да. Много детергенти поглъщат светлина близо до 280 nm, което може да изкриви резултата. Използването на празна проба със същата концентрация на детергент помага да се компенсира тази фонова абсорбция. При много високи концентрации на детергент може да е необходим съвместим с детергенти анализ, например BCA.