Calcula l'eficiència de PCR a partir dels valors de Ct i els factors de dilució. Analitza corbes estàndard, determina l'eficiència d'amplificació i valida els teus experiments de PCR quantitativa.
El valor ha de ser positiu
El valor ha de ser positiu
El valor ha de ser positiu
El valor ha de ser positiu
El valor ha de ser positiu
Introduïu dades vàlides per generar el gràfic
L'eficiència de qPCR és una mesura de com de bé funciona la reacció de PCR. Una eficiència del 100% significa que la quantitat de producte de PCR es duplica amb cada cicle durant la fase exponencial.
L'eficiència es calcula a partir de la pendència de la corba estàndard, que s'obté traçant els valors Ct contra el logaritme de la concentració inicial de plantilla (sèrie de dilucions).
L'eficiència (E) es calcula utilitzant la fórmula:
E = 10^(-1/slope) - 1
L'eficiència de la Reacció en Cadena de la Polimerasa Quantitativa (qPCR) és un paràmetre crític que impacta directament en l'exactitud i fiabilitat dels teus experiments de qPCR. La calculadora d'eficiència de qPCR ajuda els investigadors a determinar quina eficiència tenen les seves reaccions de PCR en l'amplificació de les seqüències d'ADN objectiu amb cada cicle tèrmic. Les reaccions de qPCR ideals haurien de tenir una eficiència entre el 90-110%, indicant que la quantitat de producte de PCR s'aproxima a duplicar-se amb cada cicle durant la fase exponencial.
Una eficiència d'amplificació deficient pot conduir a una quantificació inexacta, resultats poc fiables i conclusions experimentals defectuoses. En calcular i monitoritzar la teva eficiència de qPCR, pots optimitzar les condicions de reacció, validar els dissenys de primers i assegurar la qualitat de les teves dades de PCR quantitativa.
Aquesta calculadora utilitza el mètode de corba estàndard, que traça els valors de llindar de cicle (Ct) contra el logaritme de la concentració de plantilla (representada per dilucions en sèrie), per determinar l'eficiència del teu assaig de qPCR. La pendent resultant d'aquesta corba estàndard s'utilitza per calcular l'eficiència d'amplificació mitjançant una fórmula matemàtica senzilla.
L'eficiència d'una reacció de qPCR es calcula a partir de la pendent de la corba estàndard mitjançant la següent fórmula:
On:
Per a una reacció de PCR ideal amb una eficiència del 100% (duplicació perfecta dels amplicons amb cada cicle), la pendent seria -3.32. Això és perquè:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (o 100%)}
El percentatge d'eficiència es calcula multiplicant l'eficiència decimal per 100:
\text{Eficiència (%)} = E \times 100\%
La corba estàndard es crea traçant els valors de Ct (eix y) contra el logaritme de la concentració inicial de plantilla o factor de dilució (eix x). La relació entre aquestes variables hauria de ser lineal, i la qualitat d'aquesta relació lineal s'avalua mitjançant el coeficient de determinació (R²).
Per a càlculs d'eficiència de qPCR fiables:
Preparació de dades: La calculadora pren els teus valors de Ct per a cada punt de dilució i el factor de dilució com a entrades.
Transformació logarítmica: La sèrie de dilucions es transforma en una escala logarítmica (log base 10).
Regressió lineal: La calculadora realitza una anàlisi de regressió lineal sobre les dades transformades logarítmicament per determinar la pendent, l'ordenada a l'origen i el valor de R².
Càlcul d'eficiència: Utilitzant el valor de la pendent, s'calcula l'eficiència mitjançant la fórmula E = 10^(-1/slope) - 1.
Interpretació de resultats: La calculadora mostra l'eficiència com un percentatge, juntament amb la pendent i el valor de R² per ajudar-te a avaluar la fiabilitat del teu assaig de qPCR.
Segueix aquests passos per calcular la teva eficiència de qPCR:
Estableix el nombre de dilucions: Selecciona quants punts de dilució tens a la teva corba estàndard (es recomana entre 3-7 punts).
Introdueix el factor de dilució: Introdueix el factor de dilució utilitzat entre mostres consecutives (per exemple, 10 per a una sèrie de dilució de 10 vegades, 5 per a una sèrie de dilució de 5 vegades).
Introdueix els valors de Ct: Introdueix els valors de Ct per a cada punt de dilució. Normalment, la primera dilució (Dilució 1) conté la concentració més alta de plantilla, resultant en el valor de Ct més baix.
Veure resultats: La calculadora calcularà automàticament i mostrarà:
Interpretar resultats: Avalua si la teva eficiència de qPCR es troba dins del rang acceptable (90-110%) i si el valor de R² indica una corba estàndard fiable (≥ 0.98).
Copia resultats: Utilitza el botó "Copia Resultats" per copiar tots els valors calculats per als teus registres o publicacions.
Fem una passejada a través d'un exemple:
Quan es traça en una corba estàndard:
La calculadora realitzarà una regressió lineal i determinarà:
Utilitzant la fórmula d'eficiència:
Això indica una bona eficiència de qPCR del 93%, que es troba dins del rang acceptable del 90-110%.
Abans d'utilitzar un nou parell de primers per a experiments quantitatius, és essencial validar el seu rendiment. Calcular l'eficiència de qPCR ajuda a:
En desenvolupar nous assaigs de qPCR, els càlculs d'eficiència són crucials per a:
En experiments de quantificació relativa, conèixer l'eficiència de PCR és essencial per a:
En entorns clínics i diagnòstics, l'eficiència de qPCR és important per a:
Per a aplicacions de seguretat ambiental i alimentària, els càlculs d'eficiència ajuden a:
Si bé el mètode de corba estàndard és l'enfocament més comú per calcular l'eficiència de qPCR, hi ha mètodes alternatius:
Aquest mètode calcula l'eficiència a partir de les dades de fluorescència d'una única corba d'amplificació, sense requerir una sèrie de dilucions. Programari com LinRegPCR analitza la fase exponencial de reaccions individuals per determinar l'eficiència.
Avantatges:
Desavantatges:
La PCR digital (dPCR) proporciona quantificació absoluta sense requerir una corba estàndard ni càlculs d'eficiència.
Avantatges:
Desavantatges:
Alguns programaris d'anàlisi de qPCR ofereixen mètodes de quantificació comparativa que estimen l'eficiència sense una corba estàndard completa.
Avantatges:
Desavantatges:
El desenvolupament de qPCR i els càlculs d'eficiència ha evolucionat significativament durant les darreres dècades:
La Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) va ser inventada per Kary Mullis el 1983, revolucionant la biologia molecular. No obstant això, la PCR tradicional només era qualitativa o semi-quantitativa. El primer sistema de PCR en temps real es va desenvolupar a principis dels anys 90 per Russell Higuchi i col·legues, que van demostrar que monitoritzar els productes de PCR a mesura que s'acumulaven (utilitzant fluorescència d'etridi) podia proporcionar informació quantitativa.
A mesura que la tecnologia de qPCR va avançar, els investigadors van reconèixer la importància de la normalització i validació. El concepte d'eficiència de PCR es va convertir en central per a la quantificació fiable:
El camp ha continuat evolucionant amb:
Avui dia, calcular i comunicar l'eficiència de qPCR es considera essencial per a la publicació de dades fiables de qPCR, i eines com aquesta calculadora ajuden els investigadors a adherir-se a les millors pràctiques en el camp.
1' Fórmula d'Excel per calcular l'eficiència de qPCR a partir de la pendent
2' Col·locar a la cel·la B2 si la pendent és a la cel·la A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Fórmula d'Excel per convertir l'eficiència a percentatge
6' Col·locar a la cel·la C2 si l'eficiència decimal és a la cel·la B2
7=B2*100
8
9' Funció per calcular l'eficiència a partir de valors de Ct i factor de dilució
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Calcular regressió lineal
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Calcular pendent
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Calcular eficiència
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# Funció R per calcular l'eficiència de qPCR a partir de valors de Ct i factor de dilució
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Crear valors de dilució logarítmica
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Realitzar regressió lineal
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extreure pendent i R-quadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Calcular eficiència
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Retornar resultats
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Exemple d'ús
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Eficiència: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Pendent: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-quadrat: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Calcular l'eficiència de qPCR a partir de valors de Ct i factor de dilució.
8
9 Parameters:
10 ct_values (list): Llista de valors de Ct
11 dilution_factor (float): Factor de dilució entre mostres consecutives
12
13 Returns:
14 dict: Diccionari que conté eficiència, pendent, r_squared i intercept
15 """
16 # Crear valors de dilució logarítmica
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Realitzar regressió lineal
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Calcular eficiència
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Traçar la corba estàndard amb la línia de regressió.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generar punts per a la línia de regressió
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Dilució')
48 plt.ylabel('Valor de Ct')
49 plt.title('Corba Estàndard de qPCR')
50
51 # Afegir equació i R² al gràfic
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Eficiència = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Exemple d'ús
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Eficiència: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Pendent: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-quadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Traçar la corba estàndard
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Calcular l'eficiència de qPCR a partir de valors de Ct i factor de dilució
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array de valors de Ct
4 * @param {number} dilutionFactor - Factor de dilució entre mostres consecutives
5 * @returns {Object} Objecte que conté eficiència, pendent, rSquared i intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Crear valors de dilució logarítmica
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Calcular mitjanes per a la regressió lineal
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Calcular pendent i intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Calcular R-quadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Calcular eficiència
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Exemple d'ús
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Eficiència: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Pendent: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-quadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Una bona eficiència de qPCR normalment es troba entre el 90% i el 110% (0.9-1.1). Una eficiència del 100% representa la duplicació perfecta del producte de PCR amb cada cicle. Eficiències fora d'aquest rang poden indicar problemes amb el disseny de primers, condicions de reacció o la presència d'inhibidors.
Les eficiències superiors al 100% poden ocórrer degut a:
Un valor baix de R² (per sota de 0.98) suggereix una mala linearitat a la teva corba estàndard, que pot ser causada per:
Per a càlculs d'eficiència fiables, es requereix un mínim de 3 punts de dilució, però es recomanen 5-6 punts per a resultats més precisos. Aquests punts haurien d'abastar tot el rang dinàmic de les concentracions de plantilla esperades en les teves mostres experimentals.
En la quantificació relativa utilitzant el mètode ΔΔCt, s'assumeix que les eficiències entre els gens objectiu i de referència són iguals (idealment 100%). Quan les eficiències difereixen significativament:
No, l'eficiència hauria de ser determinada per cada parell de primers i hauria de ser revalidada:
Els inhibidors de PCR poden:
Els termes s'utilitzen sovint de manera interchangeable, però:
Per millorar l'eficiència de qPCR:
No es recomana comparar mostres amb eficiències significativament diferents perquè:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
La nostra Calculadora d'Eficiència de qPCR proporciona una eina senzilla però poderosa per als investigadors per validar i optimitzar els seus experiments de PCR quantitativa. En calcular amb precisió l'eficiència a partir de corbes estàndard, pots assegurar una quantificació fiable, solucionar problemes d'assaigs problemàtics i adherir-te a les millors pràctiques en l'experimentació de qPCR.
Prova la nostra calculadora avui mateix per millorar la qualitat i fiabilitat de les teves dades de qPCR!
Descobreix més eines que podrien ser útils per al teu flux de treball