Calculadora d'Eficiència de qPCR: Eina d'Anàlisi de Corba Estàndard

Calculadora d’eficiència de la qPCR

Una calculadora d’eficiència de qPCR estima fins a quin punt una reacció de PCR quantitativa (qPCR) copia la seqüència d’ADN diana en cada cicle d’amplificació. Utilitza els valors Ct (el número de cicle en què el senyal fluorescent travessa un llindar establert) d’una sèrie de dilucions per calcular l’eficiència, el pendent, l’ordenada a l’origen i R².

Què és l’eficiència de la qPCR?

La PCR quantitativa segueix la fluorescència mentre una reacció copia una seqüència d’ADN diana, cicle a cicle. L’eficiència d’amplificació descriu quant augmenta la quantitat d’ADN diana en cada cicle. Amb una eficiència del 100 %, la quantitat d’ADN diana es duplica en cada cicle.

Les reaccions reals rarament arriben exactament al 100 %. La majoria de laboratoris consideren acceptable una eficiència entre 90 % i 110 % per a una quantificació fiable. Un valor inferior a 90 % o superior a 110 % indica un problema, com ara un disseny deficient dels encebadors, inhibidors de la PCR arrossegats durant l’extracció de la mostra o errors de pipeteig en la sèrie de dilucions.

L’eficiència és especialment important quan es compara l’expressió gènica entre mostres. El mètode habitual ΔΔCt per calcular el canvi relatiu suposa que totes les reaccions funcionen amb una eficiència del 100 %. Quan l’eficiència mesurada difereix del 100 %, o quan un gen diana i un gen de referència tenen eficiències diferents, els resultats del canvi relatiu poden ser inexactes.

Fórmula de l’eficiència de la qPCR

L’eficiència es calcula a partir del pendent de la corba estàndard, una recta obtinguda representant els valors Ct respecte del logaritme en base 10 (log10) de la quantitat inicial d’ADN en una sèrie de dilucions.

E = 10^(-1/pendent) - 1

E és l’eficiència, expressada com a decimal (cal multiplicar-la per 100 per obtenir el percentatge). El pendent és el pendent de la recta de la corba estàndard. És negatiu, perquè el Ct augmenta a mesura que disminueix la quantitat inicial d’ADN.

Un pendent de -3,32 correspon a una eficiència del 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Això funciona perquè una dilució de 10 vegades hauria de desplaçar el Ct aproximadament 3,32 cicles si la reacció duplica l’ADN en cada cicle, ja que log2(10) és aproximadament 3,32.

A la pràctica, es considera acceptable un pendent entre -3,1 i -3,6. Aquest interval correspon a una eficiència aproximadament del 90 % al 110 %. Un pendent més proper a -3,1 dona una eficiència calculada més alta; un pendent més proper a -3,6 en dona una de més baixa.

Com calcular l’eficiència de la qPCR: el mètode de la corba estàndard

Prepareu una sèrie de dilucions. Comenceu amb la mostra més concentrada i diluïu-la amb un factor fix, habitualment 10 vegades, per a cada mostra següent. Feu una qPCR de cada dilució i anoteu-ne el valor Ct.
Convertiu cada dilució en un valor log10. Si la primera mostra, la més concentrada, es compta com a posició 0, la mostra número i té un log10 de la quantitat relativa igual a -i × log10(factor de dilució).
Representeu el Ct (eix vertical) respecte del valor log10 (eix horitzontal) per a cada dilució i feu una regressió lineal.
Llegiu el pendent, la intersecció i R² de la recta de regressió.
Introduïu el pendent a E = 10^(-1/pendent) - 1 per obtenir l’eficiència.

Criteris de qualitat de la corba estàndard

R² d’almenys 0,98. Mesura fins a quin punt els punts s’ajusten a una recta. Un valor més baix sovint indica errors de pipeteig o una amplificació inconsistent.
Pendent entre -3,1 i -3,6. Aquest interval correspon a una eficiència del 90–110%.
Almenys tres punts de dilució. Cinc o sis punts donen una recta més fiable i faciliten la detecció d’un valor atípic.
La mostra més concentrada hauria de donar un Ct al voltant de 15-20. La mostra més diluïda s’hauria de mantenir per sota d’un Ct de 35, ja que els valors superiors s’acosten al límit de detecció.

Exemple resolt

Una sèrie de dilucions de cinc punts, amb una dilució de 10 vegades, dona aquests valors Ct, de la més concentrada a la menys concentrada: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Els valors de log10(quantitat relativa) són 0, -1, -2, -3, -4, ja que cada pas de dilució afegeix -log10(10), o -1. El Ct augmenta 3,5 cicles en cada pas, de manera que els punts formen una recta i la regressió lineal dona:

Pendent: -3,5
Intersecció: 15,0
R²: 1,0

Eficiència: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, o aproximadament 93 %.

Una eficiència del 93 % amb R² = 1,0 compleix els criteris de qualitat estàndard i és adequada per a la quantificació de l’expressió gènica.

Exemple de codi

Aquesta funció de JavaScript segueix el mateix mètode que la calculadora. L’índex de cada valor Ct es nega abans de calcular-ne el logaritme, perquè la primera mostra, la més concentrada, té la quantitat relativa més alta i cada mostra posterior està més diluïda.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Per què és important l’eficiència per a l’expressió gènica

Els càlculs del canvi relatiu, inclòs el mètode ΔΔCt, parteixen del supòsit que la quantitat de diana es duplica en cada cicle de reacció. Quan un gen diana i un gen de referència tenen eficiències mesurades diferents, la fórmula simple ΔΔCt introdueix un error. Els investigadors sovint passen a un càlcul corregit per l’eficiència, com el mètode de correcció per eficiència descrit per Michael Pfaffl a 2001, quan les eficiències difereixen en més d’uns cinc punts percentuals. Les directrius MIQE, un conjunt de normes per a la presentació de resultats àmpliament citat en l’àmbit de la qPCR i publicat el 2009, recomanen que els estudis informin de l’eficiència calculada, el pendent i R² juntament amb els resultats de quantificació.

Preguntes més freqüents

Quin és un bon percentatge d’eficiència de la qPCR?

Generalment s’accepta un valor entre 90 % i 110 %, i els assajos ben optimitzats se situen al voltant de 95–105%. Un pendent de -3,32 correspon exactament a una eficiència del 100 %.

Per què la meva eficiència de qPCR és superior a 110 %?

Les causes habituals inclouen errors de pipeteig de la sèrie de dilucions, dímers de primers, inhibidors que afecten de manera desigual les mostres concentrades i diluïdes, o un llindar de fluorescència establert fora de la fase exponencial de l’amplificació. Una corba de fusió amb més d’un pic pot indicar la presència de dímers de primers.

Per què la meva eficiència de qPCR és inferior a 90 %?

Les causes probables inclouen un disseny deficient dels encebadors, inhibidors de la PCR arrossegats durant l’extracció de la mostra o una temperatura d’aparellament subòptima. Comprovar l’especificitat dels encebadors i fer un gradient de temperatures pot ajudar a trobar-ne la causa.

Què significa un valor R² baix?

R² mesura fins a quin punt els valors Ct s’ajusten a una recta respecte de la quantitat en escala logarítmica. Un valor inferior a 0,98 suggereix una inconsistència en el pipeteig, una mostra inhibida o un punt de dilució proper al límit de detecció.

Quants punts de dilució necessita una corba estàndard?

Almenys tres, el mínim necessari per a una regressió lineal. Cinc o sis punts donen un pendent més fiable i faciliten la detecció de valors atípics.

Pot canviar l’eficiència entre experiments?

Sí. Un lot nou de reactius, un lot nou d’encebadors, un tipus de mostra diferent o un instrument de qPCR diferent poden modificar l’eficiència. Molts laboratoris tornen a comprovar l’eficiència cada pocs mesos o amb cada lot nou de reactius.

Referències

Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. Les directrius MIQE: informació mínima per a la publicació d’experiments de PCR quantitativa en temps real. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
Pfaffl MW. Un nou model matemàtic per a la quantificació relativa en RT-PCR en temps real. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Com de bona és una estimació de l’eficiència de la PCR: recomanacions per a una avaluació precisa i fiable de l’eficiència de la qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.

Calculadora d'Eficiència de qPCR: Eina d'Anàlisi de Corba Estàndard