Calcula els volums òptims per a les reaccions de lligadura de DNA introduint les concentracions, longituds i relacions molars de vector i inserit. Eina essencial per a la biologia molecular i l'enginyeria genètica.
La lligadura de DNA és una tècnica crítica de biologia molecular utilitzada per unir fragments de DNA mitjançant enllaços covalents. La Calculadora de Lligadura de DNA és una eina essencial per als investigadors, ajudant a determinar les quantitats òptimes de DNA de vector i insert necessari per a reaccions de lligadura exitoses. Mitjançant el càlcul de les proporcions molars correctes entre el vector (plasmid) i els fragments de DNA d'inserció, aquesta calculadora assegura experiments d'clonació molecular eficients mentre minimitza els reactius malgastats i les reaccions fallides.
Les reaccions de lligadura són fonamentals per a l'enginyeria genètica, la biologia sintètica i els procediments de clonació molecular. Permeten als científics crear molècules de DNA recombinants inserint gens d'interès en vectors de plasmid per a la seva posterior transformació en organismes hoste. L'èxit d'aquestes reaccions depèn en gran mesura de l'ús de les quantitats apropiades de components de DNA, que és precisament el que aquesta calculadora ajuda a determinar.
Ja sigui que estiguis construint vectors d'expressió, creant biblioteques de gens o realitzant subclonacions rutinàries, aquesta calculadora de lligadura de DNA t'ajudarà a optimitzar les teves condicions experimentals i augmentar la teva taxa d'èxit. Mitjançant la introducció d'uns quants paràmetres clau sobre les teves mostres de DNA, pots obtenir ràpidament els volums exactes necessaris per a la teva reacció de lligadura específica.
La calculadora de lligadura de DNA utilitza una fórmula fonamental de biologia molecular que té en compte les diferents mides i concentracions dels fragments de DNA que s'uneixen. El càlcul principal determina quanta quantitat de DNA d'inserció es necessita en relació amb el DNA de vector en funció de les seves respectives llargades i la proporció molar desitjada.
La quantitat de DNA d'inserció necessària (en nanograms) es calcula mitjançant la següent fórmula:
On:
Un cop determinada la quantitat requerida de DNA d'inserció, es calculen els volums necessaris per a la reacció:
Anem a treballar un exemple pràctic:
Pas 1: Calcular la quantitat d'inserció necessària
Pas 2: Calcular els volums
Aquest càlcul assegura que hi ha tres molècules d'inserció per cada molècula de vector en la reacció, optimitzant les possibilitats d'una lligadura exitosa.
La nostra calculadora de lligadura de DNA està dissenyada per ser intuïtiva i senzilla. Segueix aquests passos per calcular els volums òptims per a la teva reacció de lligadura:
Introdueix la Informació del Vector:
Introdueix la Informació de l'Inserció:
Estableix els Paràmetres de Reacció:
Veure Resultats:
Copia Resultats (opcional):
La calculadora realitza verificacions de validació per assegurar-se que totes les entrades són números positius i que el volum total és suficient per als volums de DNA requerits. Si es detecten errors, missatges d'error útils us guiaran per corregir les entrades.
La calculadora de lligadura de DNA és valuosa en nombroses aplicacions de biologia molecular:
El cas d'ús més comú és la clonació molecular estàndard, on els investigadors inserten gens o fragments de DNA en vectors de plasmid. La calculadora assegura condicions òptimes per a:
En biologia sintètica, on sovint s'assemblen múltiples fragments de DNA:
En el desenvolupament d'eines diagnòstiques moleculars:
Per a investigadors que treballen en la producció de proteïnes:
En aplicacions d'edició genòmica:
La calculadora és particularment valuosa per a escenaris de lligadura desafiadors:
Si bé la nostra calculadora de lligadura de DNA proporciona càlculs precisos per a reaccions de lligadura tradicionals, existeixen diversos enfocaments alternatius per unir fragments de DNA:
Gibson Assembly: Utilitza exonuclease, polimerasa i ligasa en una reacció d'un sol tub per unir fragments de DNA superposats. No es necessita càlcul de lligadura tradicional, però les proporcions de concentració segueixen sent importants.
Assemblatge Golden Gate: Utilitza enzims de restricció tipus IIS per a l'assemblatge direccional i sense cicatrius de múltiples fragments. Requereix quantitats equimolars de tots els fragments.
SLIC (Clonació Independent de Lligadura i Seqüència): Utilitza exonuclease per crear sobresortides d'una sola cadena que s'anneguen juntes. Normalment utilitza proporcions equimolars de fragments.
In-Fusion Cloning: Sistema comercial que permet unir fragments amb superposicions de 15 bp. Utilitza una proporció específica basada en les mides dels fragments.
Gateway Cloning: Utilitza recombinació específica de llocs en comptes de lligadura. Requereix vectors d'entrada i destinació específics.
Proves Empíriques: Algunes laboratoris prefereixen configurar múltiples reaccions de lligadura amb diferents proporcions d'inserció:vector (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) i determinar quina funciona millor per als seus constructes específics.
Calculadores de Programari: Paquets de programari comercials com Vector NTI i SnapGene inclouen calculadores de lligadura amb característiques addicionals com l'anàlisi de llocs de restricció.
El desenvolupament dels càlculs de lligadura de DNA paral·lels l'evolució de les tècniques de clonació molecular, que han revolucionat la biologia molecular i la biotecnologia.
El concepte de lligadura de DNA per a la clonació molecular va emergir a principis dels anys 70 amb el treball pioner de Paul Berg, Herbert Boyer i Stanley Cohen, que van desenvolupar les primeres molècules de DNA recombinants. Durant aquest període, les reaccions de lligadura eren en gran mesura empíriques, amb investigadors utilitzant el mètode d'assaig i error per determinar les condicions òptimes.
El descobriment d'enzims de restricció i DNA ligasa va proporcionar les eines essencials per tallar i tornar a unir molècules de DNA. La T4 DNA ligasa, aïllada d'E. coli infectades pel bacteriòfag T4, es va convertir en l'enzim estàndard per unir fragments de DNA gràcies a la seva capacitat per lligar tant extrems plans com cohesius.
A mesura que la clonació molecular es va convertir en una pràctica més rutinària, els investigadors van començar a desenvolupar enfocaments més sistemàtics per a les reaccions de lligadura. La importància de les proporcions molars entre el DNA de vector i d'inserció es va fer evident, portant al desenvolupament de la fórmula bàsica que s'utilitza encara avui.
Durant aquest període, els investigadors van establir que un excés de DNA d'inserció (normalment una proporció de 3:1 a 5:1) millora generalment l'eficiència de lligadura per a aplicacions de clonació estàndard. Aquest coneixement es va compartir inicialment a través de protocols de laboratori i va arribar gradualment als manuals i llibres de text de biologia molecular.
L'aparició d'eines computacionals i calculadores en línia als anys 2000 va fer que els càlculs precisos de lligadura fossin més accessibles per als investigadors. A mesura que les tècniques de biologia molecular es van fer més sofisticades, la necessitat de càlculs precisos es va fer més crítica, especialment per a projectes de clonació desafiadors que impliquen múltiples fragments o inserts grans.
Avui dia, els càlculs de lligadura de DNA són una part integral dels fluxos de treball de clonació molecular, amb calculadores dedicades com aquesta ajudant els investigadors a optimitzar els seus experiments. La fórmula bàsica ha romàs en gran mesura inalterada, tot i que la nostra comprensió dels factors que afecten l'eficiència de la lligadura ha millorat.
L'emergència de mètodes de clonació alternatius com Gibson Assembly i Golden Gate cloning ha introduït noves necessitats de càlcul, però el concepte fonamental de proporcions molars entre fragments de DNA continua sent important a través d'aquestes tècniques.
Aquí hi ha implementacions de la calculadora de lligadura de DNA en diversos llenguatges de programació:
1' Funció VBA d'Excel per a la Calculadora de Lligadura de DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3 ' Calcular la quantitat d'inserció requerida en ng
4 CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8 ' Calcular el volum de vector en μL
9 CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13 ' Calcular el volum d'inserció en μL
14 CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18 ' Calcular el volum de buffer/aigua en μL
19 CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Exemple d'ús en una cel·la:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
241def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration,
2 insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3 """
4 Calcular volums per a una reacció de lligadura de DNA.
5
6 Paràmetres:
7 vector_concentration (float): Concentració de DNA de vector en ng/μL
8 vector_length (float): Longitud del DNA de vector en parells de bases
9 insert_concentration (float): Concentració de DNA d'inserció en ng/μL
10 insert_length (float): Longitud del DNA d'inserció en parells de bases
11 molar_ratio (float): Proporció molar desitjada d'inserció:vector
12 total_volume (float): Volum total de reacció en μL
13 vector_amount (float): Quantitat de DNA de vector a utilitzar en ng (per defecte: 50)
14
15 Retorna:
16 dict: Diccionari que conté volums i quantitats calculades
17 """
18 # Calcular volum de vector
19 vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20
21 # Calcular quantitat d'inserció requerida
22 vector_length_kb = vector_length / 1000
23 insert_length_kb = insert_length / 1000
24 insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25
26 # Calcular volum d'inserció
27 insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28
29 # Calcular volum de buffer/aigua
30 buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31
32 return {
33 "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34 "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35 "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36 "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37 "vector_amount": vector_amount
38 }
39
40# Exemple d'ús
41result = calculate_ligation_volumes(
42 vector_concentration=50,
43 vector_length=3000,
44 insert_concentration=25,
45 insert_length=1000,
46 molar_ratio=3,
47 total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Inserció: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
541function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration,
2 insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3 // Convertir longitud a kb per al càlcul
4 const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5 const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6
7 // Calcular la quantitat d'inserció requerida
8 const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9
10 // Calcular volums
11 const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12 const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13 const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14
15 return {
16 vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17 insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18 bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19 insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20 vectorAmount: vectorAmount
21 };
22}
23
24// Exemple d'ús
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Inserció: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
301public class DNALigationCalculator {
2 public static class LigationResult {
3 public final double vectorVolume;
4 public final double insertVolume;
5 public final double bufferVolume;
6 public final double insertAmount;
7 public final double vectorAmount;
8
9 public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume,
10 double insertAmount, double vectorAmount) {
11 this.vectorVolume = vectorVolume;
12 this.insertVolume = insertVolume;
13 this.bufferVolume = bufferVolume;
14 this.insertAmount = insertAmount;
15 this.vectorAmount = vectorAmount;
16 }
17 }
18
19 public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20 double vectorConcentration, double vectorLength,
21 double insertConcentration, double insertLength,
22 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23
24 // Convertir longitud a kb
25 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27
28 // Calcular la quantitat d'inserció requerida
29 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30
31 // Calcular volums
32 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35
36 // Arrodonir a 2 decimals
37 vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38 insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39 bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40 insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41
42 return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43 }
44
45 public static void main(String[] args) {
46 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47
48 System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49 System.out.printf("Inserció: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50 System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51 System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52 }
53}
541#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6 double vectorVolume;
7 double insertVolume;
8 double bufferVolume;
9 double insertAmount;
10 double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14 double vectorConcentration, double vectorLength,
15 double insertConcentration, double insertLength,
16 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17
18 // Convertir longitud a kb
19 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21
22 // Calcular la quantitat d'inserció requerida
23 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24
25 // Calcular volums
26 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29
30 // Arrodonir a 2 decimals
31 vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32 insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33 bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34 insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35
36 return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41
42 std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43 std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44 std::cout << "Inserció: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45 std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46 std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47
48 return 0;
49}
50La proporció molar òptima d'inserció a vector normalment varia entre 3:1 i 5:1 per a aplicacions de lligadura estàndard. No obstant això, això pot variar depenent de l'escenari de lligadura específic:
Diversos factors poden afectar l'eficiència de lligadura més enllà de la proporció molar:
Normalment, es recomana utilitzar entre 50 i 100 ng de DNA de vector per a reaccions de lligadura estàndard. Utilitzar massa vector pot conduir a un major fons de vector no tallat o auto-lligat, mentre que massa poc pot reduir l'eficiència de transformació. Per a lligadures desafiadores, pot ser necessari optimitzar aquesta quantitat.
Sí. Les lligadures d'extrems plans són generalment menys eficients que les d'extrems adhesius (extrems cohesius). Per a lligadures d'extrems plans, utilitza:
Per a l'assemblatge de múltiples fragments:
Aquesta calculadora està dissenyada específicament per a la clonació basada en enzims de restricció i lligasa tradicionals. Per a Gibson Assembly, normalment es recomanen quantitats equimolars de tots els fragments (proporció 1:1), tot i que el càlcul bàsic de la quantitat de DNA basat en la longitud és similar. Per a Golden Gate Assembly, també s'utilitzen normalment proporcions equimolars de tots els components.
La dephosphorylation del vector (eliminant els grups fosfat 5') impedeix la lligadura pròpia però no canvia els càlculs de quantitat. No obstant això, per a vectors dephosphorylated:
El volum mínim pràctic de reacció és normalment de 10 μL, que permet una mescla adequada i evita problemes d'evaporació. Si els teus volums de DNA calculats superen el volum de reacció desitjat, tens diverses opcions:
Els temps d'incubació òptims varien segons el tipus de lligadura:
Sí, les mescles de lligadura es poden emmagatzemar normalment a -20°C i reutilitzar per a la transformació. No obstant això, cada cicle de congelació-descongelació pot reduir l'eficiència. Per obtenir els millors resultats:
Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/
Descobreix més eines que podrien ser útils per al teu flux de treball