Calculadora de Lligació de DNA - Calcula les Ràtios d'Insert:Vector per a la Clonació Molecular

La ligació d’ADN és el pas de la clonació molecular en què un fragment inserit s’uneix a un vector plasmídic mitjançant l’enzim T4 DNA ligase. Una calculadora de ligació d’ADN determina quants microlitres d’ADN inserit i d’ADN vectorial cal barrejar perquè la reacció assoleixi una proporció molar escollida d’inserit respecte del vector.

Què fa la calculadora

La calculadora té sis entrades: concentració del vector, longitud del vector, concentració de l’inserit, longitud de l’inserit, proporció molar objectiu d’inserit respecte del vector i volum total de la reacció. També permet establir quina quantitat d’ADN vectorial s’ha d’utilitzar, que per defecte és de 50 nanograms (ng). A partir d’aquests valors calcula el volum de vector que cal pipetejar, el volum d’inserit que cal pipetejar i la quantitat de tampó o aigua que cal afegir per assolir el volum total de la reacció.

La concentració es mesura en nanograms per microlitre (ng/μL) i normalment es determina amb un instrument Nanodrop o Qubit. La longitud es mesura en parells de bases (bp). Un quilobase (kb) equival a 1000 parells de bases. La proporció molar descriu quantes molècules d’inserit hi ha d’haver per cada molècula de vector. No és una proporció de massa.

Per què s’utilitza la proporció molar i no la massa

Masses iguals d’ADN no contenen el mateix nombre de molècules. Un inserit curt pesa menys que un vector llarg amb el mateix nombre de molècules. Barrejar quantitats iguals en nanograms d’un inserit curt i d’un vector llarg donaria lloc a massa poques molècules d’inserit en relació amb les molècules de vector. La calculadora escala la massa de l’inserit segons la proporció entre les longituds dels fragments, de manera que la barreja final tingui el nombre previst de molècules d’inserit per molècula de vector.

Fórmula de la ligació d’ADN

La quantitat necessària d’ADN inserit, en nanograms, és:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

on $m_i$ és la quantitat d’inserit en nanograms, $m_v$ la quantitat de vector en nanograms, $k_i$ la longitud de l’inserit en quilobases, $k_v$ la longitud del vector en quilobases i R la proporció molar objectiu d’inserit respecte del vector.

Un cop coneguda aquesta quantitat, la calculadora converteix cada quantitat en un volum que es pot pipetejar:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

on $V_v$ i $V_i$ són els volums del vector i de l’inserit en microlitres, $c_v$ i $c_i$ són les concentracions del vector i de l’inserit en nanograms per microlitre, $V_b$ és el volum de tampó i $V_t$ el volum total de la reacció.

Si els volums del vector i de l’inserit junts són superiors al volum total de la reacció, no queda espai per al tampó, la ligasa ni l’aigua. En aquest cas, la calculadora indica que el volum total és massa petit en lloc de mostrar una quantitat negativa de tampó.

Exemple resolt

Un investigador clona un fragment gènic de 1 kb en un vector plasmídic de 3 kb. El pla és utilitzar 50 ng d’ADN vectorial amb una proporció molar d’inserit respecte del vector de 3:1, en una reacció de 20 μL.

Entrades:

• Concentració del vector: 50 ng/μL
• Longitud del vector: 3000 bp (3 kb)
• Concentració de l’inserit: 25 ng/μL
• Longitud de l’inserit: 1000 bp (1 kb)
• Proporció molar: 3
• Volum total: 20 μL
• Quantitat de vector: 50 ng

Pas 1: quantitat d’inserit

ng d’inserit = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Pas 2: volums

Volum de vector = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volum d’inserit = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volum de tampó = 20 − 1 − 2 = 17 μL

La reacció consta de 1 μL de vector, 2 μL d’inserit i 17 μL de tampó o aigua, que és també on s’afegeixen la ligasa i el seu tampó de reacció. Aquesta barreja proporciona tres molècules d’inserit per cada molècula de vector.

Proporcions molars habituals per a la ligació

En la majoria de clonacions estàndard amb extrems cohesius i sortints s’utilitza una proporció d’inserit respecte del vector de 3:1. Les lligacions entre extrems roms són menys eficients, per la qual cosa és habitual una proporció més alta, com ara 5:1. Els inserits molt grans de vegades funcionen millor amb una proporció més baixa, més propera a 1:1, ja que els fragments grans ja aporten molts parells de bases per molècula.

Preguntes més freqüents

Què és la ligació d’ADN?

La ligació d’ADN és la unió de dos fragments d’ADN, normalment un vector plasmídic i un inserit, en una única molècula contínua. L’enzim T4 DNA ligase segella la connexió entre els extrems dels fragments.

Què significa la proporció molar d’inserit respecte del vector?

És el nombre de molècules d’ADN inserit presents per cada molècula de vector en la reacció. Una proporció de 3:1 significa tres molècules d’inserit per cada molècula de vector, independentment de la relació entre les seves masses.

Per què no s’utilitzen quantitats iguals en nanograms de vector i d’inserit?

Els fragments d’ADN de longituds diferents tenen masses diferents per molècula. Un inserit d’1 kb pesa aproximadament un terç del que pesa un vector de 3 kb, molècula per molècula. Quantitats iguals en nanograms de cadascun no donarien el mateix nombre de molècules, de manera que la calculadora ajusta la massa de l’inserit per assolir la proporció molar objectiu.

Què significa que el volum total sigui massa petit?

Significa que els volums del vector i de l’inserit per si sols ja ocupen tot el volum de la reacció i no deixen espai per al tampó o la ligasa. La solució és augmentar el volum total de la reacció o utilitzar solucions d’ADN més concentrades.

Es pot utilitzar aquesta calculadora per a l’assemblatge de Gibson o la clonació Golden Gate?

No. Aquests mètodes utilitzen una química de reacció diferent i normalment tenen com a objectiu quantitats equimolars de tots els fragments, en lloc d’una proporció fixa d’inserit respecte del vector. Els seus càlculs de volum difereixen dels de la clonació estàndard amb T4 DNA ligase.

Quina quantitat d’ADN vectorial s’utilitza habitualment?

50 ng és una quantitat inicial habitual per a una reacció de ligació estàndard. Els laboratoris també utilitzen quantitats d’entre 25 i 100 ng, ajustades a la concentració de l’ADN i a l’escala de la reacció.