Calculadora de Concentració de DNA | Convertidor A260 a ng/μL
Converteix lectures d'absorbància A260 a concentracions de DNA (ng/μL) instantàniament. Gestiona factors de dilució, calcula el rendiment total. Eina gratuïta per a laboratoris de biologia molecular.
Calculadora de Concentració d'ADN
Paràmetres d'Entrada
Resultat del Càlcul
La concentració d'ADN es calcula amb la fórmula següent:
Visualització de Concentració
Documentació
Calculadora de concentració d’ADN
Una calculadora de concentració d’ADN converteix una lectura d’absorbància UV a 260 nanòmetres, anomenada A260, en concentració d’ADN en nanograms per microlitre (ng/µL). També indica la quantitat total d’ADN d’una mostra, en micrograms (µg).
Què és l’absorbància A260?
A260 és l’absorbància d’una solució a una longitud d’ona de 260 nanòmetres. L’ADN absorbeix la llum UV amb més intensitat prop d’aquesta longitud d’ona a causa de les seves bases nucleotídiques. Un espectrofotòmetre mesura A260 després d’una lectura del blanc, en què s’utilitza el mateix tampó que per a la mostra per eliminar l’absorbància de fons. Com més ADN hi ha a la solució, més alta és la lectura d’A260.
Fórmula de la concentració d’ADN
L’ADN bicatenari absorbeix la llum UV en proporció a la seva concentració, una relació coneguda com a llei de Beer-Lambert. En un camí òptic estàndard d’1 centímetre, una solució amb una lectura d’A260 de 1,0 conté aproximadament 50 ng/µL d’ADN bicatenari. Aquest valor, el factor de conversió, transforma qualsevol lectura d’A260 en una concentració:
Concentració d’ADN (ng/µL) = A260 × 50 × factor de dilució
El factor de dilució té en compte qualsevol dilució feta abans de mesurar la mostra. Una mostra mesurada sense dilució té un factor de dilució d’1.
Com es calcula el rendiment total d’ADN
Un cop coneguda la concentració, la massa total d’ADN de la mostra es pot determinar a partir del seu volum:
ADN total (µg) = concentració (ng/µL) × volum (µL) ÷ 1000
Com es calcula la concentració d’ADN: pas a pas
- Barregeu bé la mostra abans de mesurar-la. L’ADN es pot adherir a les parets del tub o sedimentar de manera desigual.
- Diluïu la mostra si està molt concentrada, amb l’objectiu d’obtenir una lectura d’A260 entre 0,1 i 1,0. Les lectures de l’espectrofotòmetre són menys fiables fora d’aquest interval.
- Poseu l’espectrofotòmetre a zero amb el mateix tampó utilitzat per a la dilució i, a continuació, mesureu la mostra a 260 nm.
- Introduïu la lectura d’A260, el volum de la mostra i el factor de dilució a la calculadora per obtenir la concentració i el rendiment total. Cal omplir els tres camps i el volum ha de ser superior a zero perquè aparegui un resultat.
Exemple resolt
Exemple 1: mostra sense diluir
Una lectura d’A260 de 0,5, sense dilució (factor de dilució 1) i un volum de mostra de 100 µL.
- Concentració = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
- ADN total = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg
Exemple 2: mostra diluïda
Un tub conté 50 µL d’ADN purificat. Una petita part s’ha diluït 10 vegades i la part diluïda ha donat una lectura d’A260 de 0,75. El factor de dilució converteix aquesta lectura de nou en la concentració del tub original, i els 50 µL són el volum introduït per al càlcul del rendiment total.
- Concentració = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
- ADN total = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg
Càlcul del factor de dilució
Factor de dilució = volum total després de la dilució ÷ volum de la mostra original.
Afegir 5 µL de solució d’ADN a 45 µL de tampó dona un volum total de 50 µL, de manera que el factor de dilució és 50 ÷ 5 = 10. Una mostra que no s’ha diluït té un factor de dilució d’1.
Intervals habituals de concentració d’ADN
La concentració depèn del tipus de mostra i del mètode d’extracció. Les extraccions d’ADN genòmic solen situar-se aproximadament entre 10 i 100 ng/µL. Les preparacions d’ADN plasmídic sovint donen concentracions més altes, de vegades de diversos centenars de ng/µL. Un resultat molt allunyat de l’interval esperat per a un mètode determinat pot indicar un problema amb l’extracció o amb la mateixa mesura.
Limitacions de la mesura de l’absorbància UV
Mesurar A260 és ràpid, però no és el mètode més sensible ni específic per a l’ADN. Les proteïnes, l’ARN i alguns components del tampó també absorbeixen llum prop de 260 nm i poden augmentar la lectura. Sovint els científics comproven la relació A260/A280 juntament amb la concentració per detectar contaminació per proteïnes; una relació propera a 1,8 sol indicar una mostra d’ADN pura. Els mètodes basats en colorants fluorescents, com els assaigs Qubit, s’uneixen només a l’ADN bicatenari i donen una lectura més precisa en mostres diluïdes o impures, tot i que requereixen reactius addicionals i un fluoròmetre.
Preguntes més freqüents
Com es calcula la concentració d’ADN a partir d’A260?
Multipliqueu la lectura d’A260 per 50, el factor de conversió estàndard per a l’ADN bicatenari, i després multipliqueu pel factor de dilució. Si la mostra no s’ha diluït, utilitzeu un factor de dilució d’1.
Quina és una bona relació A260/A280?
Una relació propera a 1,8 sol indicar una mostra d’ADN pura. Una relació més baixa suggereix contaminació per proteïnes. Una relació superior a 2,0 pot indicar contaminació per ARN.
Es pot utilitzar aquesta calculadora per a l’ARN?
No directament, perquè per a l’ARN s’utilitza un factor de conversió de 40 ng/µL en lloc d’50. Per estimar la concentració d’ARN, multipliqueu el resultat de la calculadora per 0,8 (40 ÷ 50), o utilitzeu directament A260 × 40 × factor de dilució.
Per què la lectura d’A260 ha d’estar entre 0,1 i 1,0?
L’absorbància es manté aproximadament proporcional a la concentració, tal com descriu la llei de Beer-Lambert, principalment dins d’aquest interval. Fora d’aquest interval, les lectures esdevenen menys fiables; per tant, una mostra massa concentrada o massa diluïda s’ha de diluir o concentrar abans de tornar-la a mesurar.
Quina diferència hi ha entre concentració i puresa?
La concentració mesura la quantitat d’ADN present, en ng/µL. La puresa mesura fins a quin punt la mostra és neta, principalment a partir de relacions d’absorbància com A260/A280. Una mostra pot tenir una concentració alta i continuar sent impura, o tenir una concentració baixa i ser molt pura.
Com es converteixen ng/µL en µg/mL?
Les dues unitats són numèricament iguals. 1 ng/µL equival a 1 µg/mL, perquè tant la unitat de massa com la unitat de volum es multipliquen per un factor de 1000.
Referències
- Sambrook, J., i Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Gallagher, S. R., i Desjardins, P. R. (2006). Quantificació d’ADN i ARN mitjançant espectroscòpia d’absorció i fluorescència. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
- Manchester, K. L. (1995). Valor de les relacions A260/A280 per mesurar la puresa dels àcids nucleics. BioTechniques, 19(2), 208–210.