Kalkulátor počtu kopií DNA | Nástroj pro genomickou analýzu

Kalkulačka počtu kopií DNA

Kalkulačka počtu kopií DNA odhaduje, kolik kopií cílové sekvence se nachází ve vzorku DNA. Vychází z koncentrace vzorku, jeho objemu a četnosti výskytu cílové sekvence v rámci delší sekvence DNA. Laboratoře molekulární biologie tento odhad používají k plánování experimentů, jako je qPCR (kvantitativní polymerázová řetězová reakce), ještě před provedením nákladnějšího a přesnějšího testu.

Co znamená počet kopií DNA

Počet kopií DNA udává, kolikrát se konkrétní sekvence vyskytuje v genomu nebo vzorku. Typický lidský gen se vyskytuje ve dvou kopiích, jedna je zděděná od každého rodiče. Tento počet může ovlivnit několik faktorů.

• Amplifikace: více než dvě kopie. Nádorové buňky často amplifikují geny podporující růst, například HER2 u některých nádorů prsu.
• Delece: méně než dvě kopie, někdy žádná. Delece mohou způsobovat genetická onemocnění.
• Duplikace: objeví se další kopie tam, kde by měla být pouze jedna nebo dvě.
• Variace počtu kopií (CNV): rozdíl v počtu kopií mezi jednotlivci, který se vyskytuje ve významné části lidského genomu.

Vzorec pro počet kopií DNA

Kalkulačka převádí počet výskytů sekvence a hmotnost vzorku na počet kopií pomocí tohoto vzorce:

$\text{Počet kopií} = \frac{\text{Počet výskytů} \times \text{Koncentrace} \times \text{Objem} \times N_A}{\text{Délka DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Kde:

• Počet výskytů — kolikrát se cílová sekvence vyskytuje v celé sekvenci DNA; překrývající se shody se započítávají samostatně.
• Koncentrace — koncentrace DNA v nanogramech na mikrolitr (ng/μL), obvykle naměřená spektrofotometrem nebo fluorometrem.
• Objem — objem vzorku v mikrolitrech (μL).
• $N_A$ — Avogadrovo číslo, 6,022 × 10²³ molekul na mol. Převádí moly DNA na počet molekul.
• Délka DNA — délka celé sekvence DNA v párech bází.
• 660 — průměrná molární hmotnost jednoho páru bází DNA v gramech na mol (g/mol). Pár bází tvoří dva spárované nukleotidy, každý z jednoho vlákna DNA.
• 10⁹ — převádí nanogramy na gramy.

Vzorec nejprve převede hmotnost vzorku na látkové množství molekul DNA, vynásobí je Avogadrovým číslem a získá tak celkový počet molekul DNA ve vzorku, poté jej vynásobí počtem výskytů cílové sekvence v každé molekule.

Jak vypočítat počet kopií DNA: řešený příklad

Uvažujme sekvenci DNA o délce 12 párů bází ATCGATCGATCG s cílovou sekvencí ATCG, koncentrací 10 ng/μL a objemem 20 μL.

Krok 1: Spočítejte výskyty. ATCG se v ATCGATCGATCG vyskytuje 3krát (na pozicích 1, 5 a 9).

Krok 2: zjistěte celkovou hmotnost DNA. Koncentrace × objem = 10 × 20 = 200 ng.

Krok 3: Převeďte na látkové množství. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Vydělte hodnotou (12 párů bází × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Výsledkem je 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Krok 4: Převeďte na počet molekul. Vynásobte Avogadrovým číslem: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekul/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molekul DNA.

Krok 5: Vynásobte počtem výskytů. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, tedy přibližně 45 621 212 121 212 kopií.

Toto číslo je tak vysoké proto, že vzorek o objemu 20 μL a koncentraci 10 ng/μL stále obsahuje biliony krátkých molekul DNA. Ve skutečných vzorcích se obvykle používají mnohem delší sekvence, což při stejné hmotnosti snižuje počet molekul.

Kde se používá analýza počtu kopií DNA

Diagnostika nádorových onemocnění. Patologické laboratoře kontrolují počet kopií HER2 v nádorové tkáni prsu. Normální buňka obsahuje dvě kopie. Nádor s amplifikací může obsahovat šest nebo více kopií, což ovlivňuje možnost léčby cílenými léky, například trastuzumabem.

Testování genetických onemocnění. Stavy, jako je DiGeorgeův syndrom, zahrnují deleci úseku chromozomu. Downův syndrom spočívá v dodatečné kopii chromozomu 21 (trizomie 21). Počítání kopií pomáhá tyto diagnózy potvrdit.

Kvantifikace transgenů a plazmidů. Výzkumníci zjišťují, kolik kopií vloženého genu se dostalo do rostlinné, živočišné nebo bakteriální buňky. Obvykle se upřednostňuje jediná kopie, protože více kopií může vést k umlčení genu buňkou.

Sledování patogenů a virové nálože. Odhady počtu kopií sledují množství virové nebo bakteriální DNA ve vzorku; tato metoda se používá při monitorování infekcí a při testování životního prostředí.

Další metody měření počtu kopií

Tato kalkulačka poskytuje rychlý odhad ze sekvenčních a koncentračních údajů. Laboratoře, které potřebují vyšší přesnost, obvykle používají jednu z těchto metod:

• Kvantitativní PCR (qPCR): amplifikuje DNA a měří ji v reálném čase; při použití kvalitní standardní křivky dosahuje přesnosti přibližně 15–20%.
• Digitální PCR (dPCR): rozdělí vzorek do tisíců drobných reakcí a přímo je spočítá, bez potřeby standardní křivky.
• Fluorescenční in situ hybridizace (FISH): vizuálně počítá sekvence přímo v buňkách nebo na chromozomech pod mikroskopem; v mnoha diagnostických laboratořích zaměřených na nádorová onemocnění jde o standardní metodu.
• Sekvenování nové generace (NGS): sekvenuje celý vzorek a současně určuje počet kopií v celém genomu.

Často kladené otázky

Co je počet kopií DNA? Je to počet výskytů dané sekvence DNA v genomu nebo vzorku. Většina lidských genů se vyskytuje ve dvou kopiích, po jedné od každého rodiče. Nadbytečné nebo chybějící kopie mohou ovlivnit zdraví a riziko onemocnění.

Jak přesná je tato kalkulačka? Poskytuje teoretický odhad založený na zadaných údajích, nikoli laboratorní měření. Přesnost závisí na přesnosti měření koncentrace a na specifičnosti cílové sekvence. Pro publikované výsledky jsou přesnější metody, jako je digitální PCR.

Lze tuto kalkulačku použít pro RNA? Ne. RNA používá místo thyminu uracil a jiný cukr, takže její molární hmotnost se od DNA liší. RNA má průměrnou molární hmotnost přibližně 330 g/mol na nukleotid, zatímco u páru bází DNA je to přibližně 660 g/mol. Použití vzorce pro DNA na údaje o RNA by vedlo k nesprávnému výsledku.

Proč se překrývající se sekvence započítává více než jednou? Kalkulačka započítává každou pozici, na které cílová sekvence odpovídá, i když se shody překrývají. V ATATAT se sekvence ATA shoduje dvakrát, na pozici 1 a na pozici 3, protože každá počáteční pozice se kontroluje samostatně.

Jaký rozsah koncentrace DNA funguje nejlépe? Koncentrace 10–100 ng/μL poskytují nejspolehlivější výsledky na běžných laboratorních přístrojích. Pod 10 ng/μL roste chyba měření a místo běžného spektrofotometru se doporučuje použít citlivější metodu, například fluorometr.

Může tato kalkulačka odhadnout počet kopií plazmidu? Ano. Jako sekvenci DNA zadejte úplnou sekvenci plazmidu a jako cílovou sekvenci jedinečný úsek vložené sekvence spolu s naměřenou koncentrací plazmidu a objemem vzorku.

Reference

1. National Human Genome Research Institute. Copy Number Variation (CNV). Genetický slovník NHGRI: CNV — počet kopií úseku DNA se mezi jednotlivci liší.
2. National Institute of Standards and Technology. CODATA value: Avogadro constant. NIST, Avogadrovo číslo — 6,022 140 76 × 10²³ mol⁻¹ (přesná hodnota).
3. MedlinePlus Genetics, U.S. National Library of Medicine. 22q11.2 deletion syndrome. Syndrom delece 22q11.2 — DiGeorgeův syndrom vzniká delecí malého úseku chromozomu 22.
4. MedlinePlus Genetics, U.S. National Library of Medicine. Down syndrome. Downův syndrom — trizomie 21 znamená tři kopie chromozomu 21 místo dvou.