Kalkulátor teploty annealingu DNA | Volný nástroj pro PCR Tm

Co je kalkulačka hybridizační teploty DNA?

Kalkulačka nasedací teploty DNA odhaduje teplotu tání (Tm) primeru DNA z jeho sekvence. Tm je teplota, při které je polovina molekul primeru navázána na cílové vlákno a polovina nikoli. Při polymerázové řetězové reakci (PCR) tato hodnota určuje teplotu, při níž se primery připojují k templátu DNA.

Proč je hybridizační teplota při PCR důležitá

PCR kopíruje cílový úsek DNA pomocí opakovaných cyklů zahřívání a ochlazování. Každý cyklus má tři kroky. Nejprve zahřátí při teplotě kolem 95 °C oddělí dvouvláknový templát. Tento krok se nazývá denaturace. Ve druhém kroku se reakce ochladí na nasedací teplotu, obvykle mezi 50 °C a 65 °C, aby se krátké primery mohly navázat na komplementární sekvence jednovláknové DNA. Ve třetím kroku teplota vzroste přibližně na 72 °C a enzym zvaný DNA polymeráza prodlouží primery a vytvoří nová vlákna DNA.

Pokud je nasedací teplota příliš nízká, primery se vážou na sekvence, které se shodují jen částečně, a vznikají další nežádoucí fragmenty DNA. Pokud je příliš vysoká, primery se nemohou stabilně navázat na templát a zkopíruje se jen málo DNA nebo žádná. Nasedací teplota je jedním z prvních nastavení, která výzkumníci upravují, když PCR reakce nefunguje.

Jak obsah GC ovlivňuje Tm

Primer se k cílové sekvenci páruje prostřednictvím vodíkových vazeb. Pár guanin-cytosin (G-C) vytváří tři vodíkové vazby. Pár adenin-thymin (A-T) vytváří dvě. Primer s větším podílem bází G a C vyžaduje k oddělení více tepla, takže má vyšší Tm než stejně dlouhý primer s větším podílem bází A a T. Obsah GC se obvykle zapisuje v procentech: počet bází G a C dělený celkovou délkou sekvence krát 100.

Vzorec pro nasedací teplotu DNA

Tato kalkulačka používá jeden ze dvou vzorců podle délky primeru.

U primerů o délce 14 nukleotidů nebo větší používá vzorec Marmura a Dotyho založený na obsahu GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Zde N_GC označuje počet bází G a C v primeru, který se počítá přímo, nikoli jako procento. N je celkový počet bází.

U primerů kratších než 14 nukleotidů používá Wallaceovo pravidlo:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G a C označují počet příslušných bází v primeru.

Oba vzorce předpokládají standardní podmínky: 50 nanomolární primer, 50 milimolární Na+ a pH 7,0 a přechodová hranice 14 bází mezi nimi se řídí toutéž konvencí.

Praktický příklad

Uvažujme primer o 19 bázích ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Jeho délka je 19, což je 14 nebo více, takže kalkulačka použije vzorec Marmura a Dotyho.

• Délka (N) = 19
• Počet G = 5, počet C = 5, takže N_GC = 10
• Obsah GC = 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19
• Tm = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19
• Tm = 64,9 − 13,8
• Tm ≈ 51,1 °C

Vzorec používá počet bází GC, 10, nikoli procentuální obsah GC, 52,6. Použití procentuální hodnoty omylem poskytne Tm přibližně 143 °C, což není realistická hodnota pro PCR reakci probíhající mezi 50 °C a 95 °C.

Jak používat tuto kalkulačku

Zadejte nebo vložte sekvenci primeru pouze pomocí písmen A, T, G a C. Kalkulačka zobrazí délku sekvence, obsah GC v procentech a vypočtenou nasedací teplotu. Výsledek lze zkopírovat do laboratorních poznámek nebo protokolu.

Volba hybridizační teploty PCR

Tm je vypočtený odhad, nikoli zaručená pracovní teplota. Mnoho protokolů PCR zahajuje vlastní krok hybridizace o několik stupňů pod vypočtenou hodnotou Tm a poté teplotu upravuje podle výsledku na gelu. U páru primerů se jako výchozí bod obvykle používá nižší z hodnot Tm obou primerů. Gradientová PCR, při níž se současně provádí několik reakcí při různých teplotách, je běžný způsob, jak testováním najít nejlepší teplotu.

Jiné způsoby odhadu Tm

Zde použité vzorce Marmura a Dotyho a Wallaceovo pravidlo jsou rychlé aproximace založené pouze na složení bází. Existují i jiné metody:

• Termodynamika nejbližších sousedů zohledňuje, jak každá dvojice sousedních bází ovlivňuje stabilitu. Autoři jednoho široce používaného nástroje pro návrh primerů ji popisují jako upřednostňovanou metodu pro oligonukleotidy o délce 8 až 40 bází.
• Vzorce korigované na koncentraci soli přidávají opravu podle koncentrace iontů Na+ nebo K+ v reakčním pufru, protože vyšší koncentrace soli stabilizuje dvoušroubovici DNA a zvyšuje Tm.

Různé kalkulačky mohou pro stejný primer uvádět různé hodnoty Tm, protože používají různé vzorce. Konečným testem zůstává provedení PCR a kontrola výsledku.

Často kladené otázky

Co je hybridizační teplota DNA?

Je to teplota, při které se primery DNA během PCR vážou na odpovídající sekvenci na templátovém vlákně. V laboratořích se obvykle nastavuje o několik stupňů níže než vypočtená teplota tání (Tm) primeru.

Jak se vypočítává Tm primeru?

U primerů o 14 bázích nebo delších platí Tm = 64,9 + 41 × (počet GC − 16,4) / délka. U primerů kratších než 14 bází platí Tm = 2 × (počet A+T) + 4 × (počet G+C).

Proč obsah GC zvyšuje Tm?

Páry bází G-C vytvářejí tři vodíkové vazby, zatímco páry A-T dvě. Primer s vyšším podílem bází G a C potřebuje k oddělení od cílové sekvence více energie, a tedy vyšší teplotu.

Má se hybridizační teplota PCR rovnat vypočtené hodnotě Tm?

Ne. Většina protokolů začíná několik stupňů pod vypočtenou hodnotou Tm a teplotu následně upravuje, protože Tm označuje bod, v němž je navázána pouze polovina primeru.

Mění délka primeru hodnotu Tm?

Ano, nikoli však jednoduchým způsobem. Délka se ve vzorci Marmura a Dotyho nachází ve jmenovateli, takže delší primer s průměrným obsahem GC nemá automaticky vyšší Tm než kratší primer bohatý na GC.

Proč se různé kalkulačky Tm neshodují?

Používají různé vzorce. Wallaceovo pravidlo, vzorec Marmura a Dotyho založený na obsahu GC, termodynamika nejbližších sousedů a vzorce korigované na koncentraci soli mohou pro stejný primer poskytnout odlišné hodnoty Tm, někdy se liší o několik stupňů.

Reference

1. ROSALIND. What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? ROSALIND Knowledge Hub — Wallaceovo pravidlo pro sekvence kratší než 14 bází, Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) / N pro delší a předpoklady 50 nM primeru, 50 mM Na+ a pH 7,0.
2. SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. PMC19045 — model nejbližších sousedů, který sčítá příspěvky každé dvojice sousedních bází.
3. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 2007. PMC1933198 — metoda nejbližších sousedů je upřednostňována pro oligonukleotidy o délce mezi 8 a 40 nt; základní vzorec je nejméně upřednostňovaný.