Hendersonův-Hasselbalchův kalkulátor: Kalkulátor pH pufru

Co je Hendersonova-Hasselbalchova kalkulačka?

Hendersonova-Hasselbalchova kalkulačka určuje pH pufračního roztoku. Pufr je směs slabé kyseliny a její konjugované báze, která odolává změnám pH při přidání malého množství kyseliny nebo zásady. Kalkulačka používá Hendersonovu-Hasselbalchovu rovnici, která spojuje pH s pKa kyseliny a s koncentracemi kyseliny a její konjugované báze.

Pufry udržují stálé pH v mnoha prostředích: v krvi, buněčných kulturách, enzymových reakcích a lékových formách. Na správném pH záleží. Malá změna pH může zpomalit enzym nebo způsobit, že se lék rozkládá rychleji.

Hendersonova-Hasselbalchova rovnice

$\text{pH} = \text{pKa} + \log_{10}\left(\frac{[\text{A}^-]}{[\text{HA}]}\right)$

• pH udává, jak kyselý nebo zásaditý je roztok.
• pKa je číslo, které popisuje, jak silně kyselina poutá svůj proton (vodíkový ion). Je rovno $-\log_{10}(K_a)$, kde $K_a$ je disociační konstanta kyseliny.
• [A⁻] je koncentrace konjugované báze v molech na litr. Jde o kyselinu poté, co ztratila svůj proton.
• [HA] je koncentrace samotné slabé kyseliny v molech na litr.

Nízké pKa znamená silnější kyselinu, která snadněji odevzdává svůj proton. Každá kyselina má vlastní konstantní hodnotu pKa.

Proč pufry nejlépe fungují v blízkosti pKa

Když se [A⁻] rovná [HA], poměr uvnitř logaritmu je 1, log10(1) je 0 a pH se rovná pKa. Jde o bod maximální pufrační kapacity, protože roztok obsahuje stejné množství kyseliny a zásady připravené absorbovat cokoli, co se přidá. Pufr dobře funguje přibližně v rozmezí jedné jednotky pH od svého pKa. Mimo toto rozmezí začne jedna ze dvou forem docházet a roztok už nedokáže odolávat změnám pH.

Jak vypočítat pH pufru

1. Zjistěte pKa kyseliny. Běžné hodnoty jsou uvedeny v tabulce níže.
2. Zadejte koncentraci konjugované báze, [A⁻], v molech na litr.
3. Zadejte koncentraci kyseliny, [HA], v molech na litr.
4. Odečtěte výsledek. Kalkulačka přičte k pKa dekadický logaritmus o základu 10 poměru zásady ke kyselině.

Kalkulačka také vykresluje křivku pufrační kapacity, která ukazuje, jak silně směs odolává změně pH v rozsahu různých hodnot pH (viz níže).

Praktický příklad

Laboratoř potřebuje fosfátový pufr o pH 7,40. Příslušné pKa fosfátu (pár H₂PO₄⁻ / HPO₄²⁻) je 7,198 při 25 °C, tedy asi 7,20.

Úpravou rovnice získáme poměr:

$\frac{[\text{A}^-]}{[\text{HA}]} = 10^{(\text{pH} - \text{pKa})} = 10^{(7.40 - 7.20)} \approx 1.585$

Pro 100 mL pufru o celkové koncentraci 0,1 M rozdělte celkové množství mezi obě formy podle tohoto poměru:

• [HPO₄²⁻] (báze) = 100 mM × 1,585 ÷ 2,585 ≈ 61,3 mM
• [H₂PO₄⁻] (kyselina) = 100 mM − 61,3 mM ≈ 38,7 mM

Kontrola v původní rovnici: pH = 7,20 + log10(61,3/38,7) = 7,20 + 0,20 = 7,40. Protože je cílové pH vyšší než pKa, potřebuje směs více báze než kyseliny.

Vzorec pufrační kapacity

Pufrační kapacita (symbol β) udává, kolik kyseliny nebo zásady může pufr absorbovat, než se jeho pH znatelně změní. U jedné slabé kyseliny a její konjugované báze je pufrační kapacita:

$\beta = 2.303 \times \frac{C \times K_a \times [\text{H}^+]}{(K_a + [\text{H}^+])^2}$

Zde $C$ je celková koncentrace pufru, $[\text{HA}] + [\text{A}^-]$. Pufrační kapacita dosahuje maxima přesně při pH = pKa, kde $[\text{H}^+] = K_a$, a rychle klesá, když se pH od pKa vzdaluje kterýmkoli směrem. Zdvojnásobení celkové koncentrace zdvojnásobí pufrační kapacitu při každém pH.

Běžné pufrační systémy a hodnoty pKa

Hodnoty pKa uvedené níže jsou hodnoty vybrané institutem NIST při 25 °C, zaokrouhlené na dvě desetinná místa.

Krev je dobře známý přirozený pufr. Udržuje se mezi pH 7,35 a 7,45 díky hydrogenuhličitanovému systému. V krvi má tento systém pracovní pKa asi 6,1, což leží daleko mimo obvyklé rozmezí ±1. Funguje proto, že tělo upravuje CO₂ dýcháním a hydrogenuhličitan ledvinami a udržuje poměr hydrogenuhličitanu ke kyselině uhličité zhruba na 20 ku 1. Pak platí pH = 6,1 + log10(20) ≈ 7,40.

Vliv teploty a koncentrace

Hodnoty pKa se běžně měří při 25 °C. Teplota pKa mění, takže pufr připravený při pokojové teplotě nebude mít při tělesné teplotě (37 °C) přesně stejné pH. Velikost posunu závisí na pufru:

• Tris se mění o velkou hodnotu, asi o 0,028 jednotky pH na °C, přičemž pH s rostoucí teplotou klesá. Pufr Tris o pH 8,00 při 25 °C ukáže při 37 °C blízko pH 7,66, tedy při nárůstu teploty o 12 °C.
• Fosfát se s teplotou posouvá jen nepatrně.
• HEPES se mění méně než Tris, ale více než fosfát.

Velmi zředěné pufry jsou také méně spolehlivé. V takovém případě začne vlastní ionizace vody a oxid uhličitý rozpuštěný ze vzduchu soupeřit s pufrem a skutečné pH se může od vypočtené hodnoty odchýlit.

Historie Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice

Americký biochemik Lawrence Henderson popsal základní vztah v roce 1908 při studiu toho, jak krev udržuje stálé pH. Jeho verze pracovala přímo s koncentrací vodíkových iontů, což je velmi malé číslo, se kterým se nepohodlně počítalo.

V roce 1916 přepsal dánský lékař Karl Hasselbalch Hendersonův vztah pomocí nově vytvořené stupnice pH a převedl jej do logaritmického tvaru používaného dnes. Díky této změně se rovnice mnohem snáze používala v laboratoři i v medicíně a od té doby je běžně využívána.

Často kladené otázky

Co Hendersonova-Hasselbalchova rovnice vypočítává? Vypočítává pH pufračního roztoku z pKa kyseliny a koncentrací kyseliny a její konjugované báze. Lze ji také upravit tak, aby určila poměr zásady ke kyselině potřebný pro cílové pH.

Kdy pufr funguje nejlépe? Pufr je nejsilnější, když je pH blízké pKa jeho kyseliny, ideálně v rozmezí jedné jednotky pH. V tomto bodě jsou kyselina a její konjugovaná báze přítomny v podobném množství, takže nejlépe odolávají změně pH.

Platí rovnice i pro kyseliny s více než jednou hodnotou pKa? Ano, vždy pro jeden disociační krok. Kyselina fosforečná má tři hodnoty pKa; pufr kolem pH 7,2 používá pouze druhou z nich (asi 7,20) a zbylé dva disociační kroky považuje při tomto pH za zanedbatelné.

Jak moc teplota ovlivňuje pH pufru? Záleží na pufru. Tris se mění asi o 0,028 jednotky pH na °C, takže pufr Tris nastavený na pH 8,00 při 25 °C ukáže při 37 °C asi pH 7,66. Fosfátové pufry a pufry HEPES jsou na teplotu méně citlivé.

Je vypočtené pH stejné jako naměřené pH? Ne přesně. Rovnice předpokládá ideální chování a nezohledňuje rozpuštěný oxid uhličitý, nečistoty ani silné iontové interakce při vysokých koncentracích solí. Pufry v laboratoři by se po přípravě měly vždy kontrolovat kalibrovaným pH metrem.

Co je pufrační kapacita? Pufrační kapacita udává, kolik kyseliny nebo zásady může pufr pojmout, než se jeho pH výrazně změní. Je nejvyšší, když se pH rovná pKa, a klesá, jak se pH od tohoto bodu vzdaluje.

Reference

1. Národní institut standardů a technologie. Goldberg, Kishore a Lennen, Thermodynamic Quantities for the Ionization Reactions of Buffers, J. Phys. Chem. Ref. Data 31 (2002). Dotisk NIST JPCRD (PDF) — vybrané hodnoty pK při 298,15 K pro pufry v tabulce, včetně fosfátu 7,198.
2. Fisher Scientific. Preparation of Tris•Cl stock solutions. List Fisher Scientific k Tris•Cl (PDF) — pH pufru Tris klesá asi o 0,028 jednotky pH na °C.
3. Merck Manual, verze pro veřejnost. Overview of Acid-Base Balance. Merck Manual: acidobazická rovnováha — normální pH krve je asi 7,35 až 7,45.
4. Merck Manual, verze pro odborníky. Acid-Base Regulation. Merck Manual: regulace acidobazické rovnováhy — CO₂ je řízen ventilací; H⁺ a HCO₃⁻ regulují ledviny.
5. Texas A&M AgriLife, katedra živočišných věd. Handout 1: Buffers and Solutions. Podklad Texas A&M o pufrech (PDF) — pKa hydrogenuhličitanu 6,1 a poměr hydrogenuhličitanu ke kyselině uhličité 20/1 při pH 7,4.
6. Clínica Universidad de Navarra. Ecuación de Henderson-Hasselbalch (ve španělštině). Heslo lékařského slovníku CUN — Hendersonův nelogaritmický tvar v roce 1908; Hasselbalchův logaritmický tvar v roce 1916.