qPCR Effektivitetsberegner: Standardkurve Analyseværktøj

Beregner til qPCR-effektivitet

En beregner til qPCR-effektivitet estimerer, hvor godt en kvantitativ PCR-reaktion (qPCR) kopierer sin mål-DNA-sekvens ved hver amplifikationscyklus. Den bruger Ct-værdier (det cyklusnummer, hvor fluorescenssignalet krydser en fastsat tærskel) fra en fortyndingsrække til at beregne effektivitet, hældning, skæringspunkt og R².

Hvad er qPCR-effektivitet?

Kvantitativ PCR registrerer fluorescens, mens en reaktion kopierer en mål-DNA-sekvens cyklus for cyklus. Amplifikationseffektivitet beskriver, hvor meget mængden af mål-DNA vokser ved hver cyklus. Ved en effektivitet på 100 % fordobles mængden af mål-DNA i hver cyklus.

Reelle reaktioner når sjældent præcis 100 %. De fleste laboratorier betragter en effektivitet mellem 90 % og 110 % som acceptabel for pålidelig kvantificering. En værdi under 90 % eller over 110 % tyder på et problem, f.eks. dårligt primerdesign, PCR-hæmmere, der er ført med fra prøveekstraktionen, eller pipetteringsfejl i fortyndingsrækken.

Effektiviteten er vigtigst ved sammenligning af genekspression mellem prøver. Den almindelige ΔΔCt-metode til beregning af fold-ændring antager, at alle reaktioner kører med en effektivitet på 100 %. Når den målte effektivitet afviger fra 100 %, eller når et målgen og et referencegen har forskellige effektiviteter, kan resultaterne for fold-ændring være unøjagtige.

Formel for qPCR-effektivitet

Effektiviteten beregnes ud fra hældningen på standardkurven, en linje dannet ved at afbilde Ct-værdier mod den base-10-logaritme (log10) af mængden af start-DNA i en fortyndingsrække.

E = 10^(-1/hældning) - 1

E er effektiviteten udtrykt som et decimaltal (multiplicer med 100 for at få procent). Hældning er standardkurvens hældning. Den er negativ, fordi Ct stiger, når mængden af start-DNA falder.

En hældning på -3,32 svarer til en effektivitet på 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Det skyldes, at en 10-foldfortynding bør forskyde Ct med cirka 3,32 cyklusser, hvis reaktionen fordobler sit DNA i hver cyklus, eftersom log2(10) er omtrent 3,32.

I praksis betragtes en hældning mellem -3,1 og -3,6 som acceptabel. Dette interval svarer til en effektivitet på cirka 90 % til 110 %. En hældning tættere på -3,1 giver en højere beregnet effektivitet, mens en hældning tættere på -3,6 giver en lavere.

Sådan beregnes qPCR-effektivitet: Metoden med standardkurve

1. Forbered en fortyndingsrække. Begynd med den mest koncentrerede prøve, og fortynd den med en fast faktor, almindeligvis 10-fold, for hver efterfølgende prøve. Kør qPCR på hver fortynding, og registrer dens Ct-værdi.
2. Omregn hver fortynding til en log10-værdi. Hvis den første, mest koncentrerede prøve tælles som position 0, har prøve nummer i log10(relativ mængde) lig med -i × log10(fortyndingsfaktor).
3. Afbild Ct (lodret akse) mod log10-værdien (vandret akse) for hver fortynding, og udfør en lineær regression.
4. Aflæs hældningen, skæringen og R² for regressionslinjen.
5. Indsæt hældningen i E = 10^(-1/hældning) - 1 for at beregne effektiviteten.

Kvalitetskriterier for standardkurven

• R² på mindst 0,98. Dette måler, hvor tæt punkterne ligger på en ret linje. En lavere værdi tyder ofte på pipetteringsfejl eller uensartet amplifikation.
• Hældning mellem -3,1 og -3,6. Dette interval svarer til en effektivitet på 90–110%.
• Mindst tre fortyndingspunkter. Fem eller seks punkter giver en mere pålidelig linje og gør det lettere at opdage en afvigende observation.
• Den mest koncentrerede prøve bør give en Ct omkring 15-20. Den mest fortyndede prøve bør have en Ct under 35, eftersom værdier over dette nærmer sig detektionsgrænsen.

Gennemregnet eksempel

En fortyndingsrække med fem punkter og 10-foldfortynding giver følgende Ct-værdier, fra mest til mindst koncentreret: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Værdierne for log10(relativ mængde) er 0, -1, -2, -3, -4, eftersom hvert fortyndingstrin tilføjer -log10(10), eller -1. Ct stiger med 3,5 cyklusser ved hvert trin, så punkterne ligger på en ret linje, og lineær regression giver:

• Hældning: -3,5
• Skæring: 15,0
• R²: 1,0

Effektivitet: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, eller cirka 93 %.

En effektivitet på 93 % med R² = 1,0 opfylder standardkriterierne for kvalitet og er egnet til kvantificering af genekspression.

Kodeeksempel

Denne JavaScript-funktion følger samme metode som beregneren. Indekset for hver Ct-værdi negeres, før logaritmen tages, fordi den første, mest koncentrerede prøve har den højeste relative mængde, og hver efterfølgende prøve er mere fortyndet.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Hvorfor effektivitet er vigtig for genekspression

Beregninger af fold-ændring, herunder ΔΔCt-metoden, antager, at hver reaktion fordobler sit mål i hver cyklus. Når et målgen og et referencegen har forskellige målte effektiviteter, medfører den almindelige ΔΔCt-formel en fejl. Forskere skifter ofte til en effektivitetskorrigeret beregning, f.eks. den metode Michael Pfaffl beskrev i 2001, når effektiviteterne afviger med mere end cirka fem procentpoint. MIQE-retningslinjerne, et bredt citeret sæt rapporteringsstandarder for qPCR offentliggjort i 2009, anbefaler, at undersøgelser rapporterer den beregnede effektivitet, hældning og R² sammen med kvantificeringsresultaterne.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er en god qPCR-effektivitet i procent?

Mellem 90 % og 110 % accepteres generelt, mens veloptimerede assays ligger omkring 95–105%. En hældning på -3,32 svarer præcis til 100 %.

Hvorfor er min qPCR-effektivitet over 110 %?

Almindelige årsager omfatter pipetteringsfejl ved fremstilling af fortyndingsrækken, primer-dimere, hæmmere, der påvirker koncentrerede og fortyndede prøver forskelligt, eller en fluorescenstærskel, der er sat uden for amplifikationens eksponentielle fase. En smeltekurve med mere end én top kan tyde på primer-dimere.

Hvorfor er min qPCR-effektivitet under 90 %?

Sandsynlige årsager omfatter dårligt primerdesign, PCR-hæmmere, der er ført med fra prøveekstraktionen, eller en uhensigtsmæssig annealingtemperatur. Kontrol af primerenes specificitet og en temperaturgradient kan hjælpe med at finde årsagen.

Hvad betyder en lav R²-værdi?

R² måler, hvor godt Ct-værdierne passer til en ret linje i forhold til log-mængden. En værdi under 0,98 tyder på uensartet pipettering, en hæmmet prøve eller et fortyndingspunkt nær detektionsgrænsen.

Hvor mange fortyndingspunkter skal en standardkurve have?

Mindst tre, hvilket er det nødvendige minimum for en lineær regression. Fem eller seks punkter giver en mere pålidelig hældning og gør det lettere at opdage afvigende observationer.

Kan effektiviteten ændre sig mellem eksperimenter?

Ja. Et nyt reagenslot, et nyt primerparti, en anden prøvetype eller et andet qPCR-instrument kan ændre effektiviteten. Mange laboratorier kontrollerer effektiviteten igen med nogle måneders mellemrum eller med hvert nyt reagenslot.

Referencer

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE-retningslinjerne: minimumsinformation til publicering af kvantitative realtids-PCR-eksperimenter. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. En ny matematisk model for relativ kvantificering ved realtids-RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Hvor god er et estimat af PCR-effektivitet: anbefalinger til præcise og pålidelige vurderinger af qPCR-effektivitet. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.