Beregn PCR-effektivitet ud fra Ct-værdier og fortyndingsfaktorer. Analyser standardkurver, bestem amplifikationseffektivitet, og valider dine kvantitative PCR-eksperimenter.
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Værdien skal være positiv
Indtast gyldige data for at generere diagram
qPCR effektivitet er et mål for, hvor godt PCR reaktionen fungerer. En effektivitet på 100% betyder, at mængden af PCR produkt fordobles med hver cyklus under den eksponentielle fase.
Effektiviteten beregnes ud fra hældningen af standardkurven, som opnås ved at plotte Ct værdierne mod logaritmen af den indledende skabelon koncentration (fortyndingsserie).
Effektiviteten (E) beregnes ved hjælp af formlen:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kvantitativ Polymerase Kædereaktion (qPCR) effektivitet er en kritisk parameter, der direkte påvirker nøjagtigheden og pålideligheden af dine qPCR eksperimenter. qPCR effektivitetsberegneren hjælper forskere med at bestemme, hvor effektivt deres PCR reaktioner forstærker mål-DNA sekvenser med hver termisk cyklus. Ideelle qPCR reaktioner bør have en effektivitet mellem 90-110%, hvilket indikerer, at mængden af PCR-produkt omtrent fordobles med hver cyklus under den eksponentielle fase.
Dårlig forstærknings effektivitet kan føre til unøjagtig kvantificering, upålidelige resultater og fejlagtige eksperimentelle konklusioner. Ved at beregne og overvåge din qPCR effektivitet kan du optimere reaktionsbetingelser, validere primerdesign og sikre kvaliteten af dine kvantitative PCR data.
Denne beregner bruger standardkurvemetoden, som plottet cyklustærskel (Ct) værdier mod logaritmen af skabelonkoncentration (repræsenteret ved serielle fortyndinger), til at bestemme effektiviteten af din qPCR assay. Den resulterende hældning af denne standardkurve bruges derefter til at beregne forstærknings effektiviteten ved hjælp af en ligetil matematisk formel.
Effektiviteten af en qPCR reaktion beregnes fra hældningen af standardkurven ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
For en ideel PCR reaktion med 100% effektivitet (perfekt fordobling af ampliconer med hver cyklus) ville hældningen være -3.32. Dette skyldes:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (eller 100%)}
Effektiviteten procent beregnes ved at multiplicere decimal effektiviteten med 100:
\text{Effektivitet (%)} = E \times 100\%
Standardkurven oprettes ved at plotte Ct værdierne (y-akse) mod logaritmen af den indledende skabelonkoncentration eller fortyndingsfaktor (x-akse). Forholdet mellem disse variabler bør være lineært, og kvaliteten af dette lineære forhold vurderes ved hjælp af determinationskoefficienten (R²).
For pålidelige qPCR effektivitetsberegninger:
Dataforberedelse: Beregneren tager dine Ct værdier for hvert fortyndingspunkt og fortyndingsfaktoren som input.
Log transformation: Fortyndingsserien transformeres til en logaritmisk skala (log base 10).
Lineær regression: Beregneren udfører lineær regressionsanalyse på de log-transformerede data for at bestemme hældningen, y-aksens skæring og R² værdi.
Effektivitetsberegning: Ved hjælp af hældningsværdien beregnes effektiviteten ved hjælp af formelen E = 10^(-1/slope) - 1.
Resultatfortolkning: Beregneren viser effektiviteten som en procentdel, sammen med hældningen og R² værdien for at hjælpe dig med at vurdere pålideligheden af din qPCR assay.
Følg disse trin for at beregne din qPCR effektivitet:
Indstil antallet af fortyndinger: Vælg, hvor mange fortyndingspunkter du har i din standardkurve (mellem 3-7 punkter anbefales).
Indtast fortyndingsfaktoren: Indtast den fortyndingsfaktor, der blev brugt mellem de på hinanden følgende prøver (f.eks. 10 for en 10-fold fortyndingsserie, 5 for en 5-fold fortyndingsserie).
Indtast Ct værdier: Indtast Ct værdierne for hvert fortyndingspunkt. Typisk indeholder den første fortynding (Fortynding 1) den højeste koncentration af skabelon, hvilket resulterer i den laveste Ct værdi.
Vis resultater: Beregneren beregner automatisk og viser:
Fortolk resultater: Vurder, om din qPCR effektivitet ligger inden for det acceptable område (90-110%) og om R² værdien indikerer en pålidelig standardkurve (≥ 0.98).
Kopier resultater: Brug knappen "Kopier Resultater" til at kopiere alle beregnede værdier til dine optegnelser eller publikationer.
Lad os gennemgå et eksempel:
Når det plottes på en standardkurve:
Beregningsprogrammet udfører lineær regression og bestemmer:
Ved hjælp af effektivitetsformlen:
Dette indikerer en god qPCR effektivitet på 93%, som ligger inden for det acceptable område på 90-110%.
Før du bruger et nyt primerpar til kvantitative eksperimenter, er det vigtigt at validere dets ydeevne. Beregning af qPCR effektivitet hjælper med at:
Når der udvikles nye qPCR assays, er effektivitetsberegninger afgørende for:
I relative kvantificerings eksperimenter er det vigtigt at kende PCR effektiviteten for:
I kliniske og diagnostiske indstillinger er qPCR effektivitet vigtig for:
For miljø- og fødevaresikkerhedsapplikationer hjælper effektivitetsberegninger med:
Mens standardkurvemetoden er den mest almindelige tilgang til at beregne qPCR effektivitet, er der alternative metoder:
Denne metode beregner effektivitet ud fra fluorescensdata fra en enkelt amplifikationskurve, uden at der kræves en fortyndingsserie. Software som LinRegPCR analyserer den eksponentielle fase af individuelle reaktioner for at bestemme effektivitet.
Fordele:
Ulemper:
Digital PCR (dPCR) giver absolut kvantificering uden at kræve en standardkurve eller effektivitetsberegninger.
Fordele:
Ulemper:
Nogle qPCR analyse software tilbyder sammenlignende kvantificeringsmetoder, der estimerer effektivitet uden en fuld standardkurve.
Fordele:
Ulemper:
Udviklingen af qPCR og effektivitetsberegninger er udviklet betydeligt i løbet af de sidste par årtier:
Polymerase Kædereaktion (PCR) blev opfundet af Kary Mullis i 1983, hvilket revolutionerede molekylærbiologi. Dog var traditionel PCR kun kvalitativ eller semi-kvantitativ. Det første realtids PCR-system blev udviklet i begyndelsen af 1990'erne af Russell Higuchi og kolleger, der demonstrerede, at overvågning af PCR produkter, mens de akkumulerede (ved hjælp af ethidiumbromid fluorescens), kunne give kvantitative oplysninger.
Som qPCR teknologi avancerede, anerkendte forskere vigtigheden af standardisering og validering. Begrebet PCR effektivitet blev centralt for pålidelig kvantificering:
Feltet er fortsat med at udvikle sig med:
I dag betragtes beregning og rapportering af qPCR effektivitet som essentielt for offentliggørelse af pålidelige qPCR data, og værktøjer som denne beregner hjælper forskere med at overholde bedste praksis inden for feltet.
1' Excel formel til at beregne qPCR effektivitet fra hældning
2' Placer i celle B2, hvis hældning er i celle A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formel til at konvertere effektivitet til procent
6' Placer i celle C2, hvis effektivitet decimal er i celle B2
7=B2*100
8
9' Funktion til at beregne effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Beregn lineær regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Beregn hældning
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Beregn effektivitet
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funktion til at beregne qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Opret log fortyndingsværdier
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Udfør lineær regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Udtræk hældning og R-kvadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Beregn effektivitet
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Returner resultater
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Eksempel på brug
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Effektivitet: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Hældning: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Beregn qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor.
8
9 Parametre:
10 ct_values (list): Liste over Ct værdier
11 dilution_factor (float): Fortyndingsfaktor mellem på hinanden følgende prøver
12
13 Returnerer:
14 dict: Ordbog, der indeholder effektivitet, hældning, r_squared og intercept
15 """
16 # Opret log fortyndingsværdier
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Udfør lineær regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Beregn effektivitet
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot standardkurven med regressionslinje.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generer punkter til regressionslinje
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Fortynding')
48 plt.ylabel('Ct Værdi')
49 plt.title('qPCR Standardkurve')
50
51 # Tilføj ligning og R² til plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Effektivitet = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Eksempel på brug
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Effektivitet: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Hældning: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plot standardkurven
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Beregn qPCR effektivitet fra Ct værdier og fortyndingsfaktor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array af Ct værdier
4 * @param {number} dilutionFactor - Fortyndingsfaktor mellem på hinanden følgende prøver
5 * @returns {Object} Objekt, der indeholder effektivitet, hældning, rSquared og intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Opret log fortyndingsværdier
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Beregn gennemsnit for lineær regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Beregn hældning og intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Beregn R-kvadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Beregn effektivitet
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Eksempel på brug
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Effektivitet: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Hældning: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60En god qPCR effektivitet ligger typisk mellem 90% og 110% (0.9-1.1). En effektivitet på 100% repræsenterer perfekt fordobling af PCR produktet med hver cyklus. Effektiviteter uden for dette interval kan indikere problemer med primerdesign, reaktionsbetingelser eller tilstedeværelsen af hæmmere.
Effektiviteter større end 100% kan forekomme på grund af:
En lav R² værdi (under 0.98) antyder dårlig linearitet i din standardkurve, hvilket kan skyldes:
For pålidelige effektivitetsberegninger kræves et minimum af 3 fortyndingspunkter, men 5-6 punkter anbefales for mere præcise resultater. Disse punkter bør spænde over hele det dynamiske område af forventede skabelonkoncentrationer i dine eksperimentelle prøver.
I relativ kvantificering ved hjælp af ΔΔCt metoden antages det, at mål- og referencegenerne har ens effektivitet (ideelt 100%). Når effektiviteten adskiller sig betydeligt:
Nej, effektivitet bør bestemmes for hvert primerpar og bør re-valideres:
PCR hæmmere kan:
Begreberne bruges ofte om hinanden, men:
For at forbedre qPCR effektivitet:
Det anbefales ikke at sammenligne prøver med betydeligt forskellige effektivitet, fordi:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Vores qPCR Effektivitetsberegner giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til forskere til at validere og optimere deres kvantitative PCR eksperimenter. Ved nøjagtigt at beregne effektivitet fra standardkurver kan du sikre pålidelig kvantificering, fejlfinde problematiske assays og overholde bedste praksis i qPCR eksperimentering.
Prøv vores beregner i dag for at forbedre kvaliteten og pålideligheden af dine qPCR data!
Opdag flere værktøjer, der måske kan være nyttige for din arbejdsgang.