DNA Koncentrationsberegner | A260 til ng/μL Konverter

Beregner til DNA-koncentration

En beregner til DNA-koncentration omregner en UV-absorbansmåling ved 260 nanometer, kaldet A260, til DNA-koncentration i nanogram pr. mikroliter (ng/µL). Den angiver også den samlede mængde DNA i en prøve i mikrogram (µg).

Hvad er A260-absorbans?

A260 er den mængde ultraviolet lys, en opløsning absorberer ved en bølgelængde på 260 nanometer. DNA absorberer UV-lys stærkest nær denne bølgelængde på grund af sine nukleotidbaser. Et spektrofotometer måler A260 efter en nulmåling, hvor den samme buffer som i prøven bruges til at fjerne baggrundsabsorbansen. Jo mere DNA der er i opløsningen, desto højere bliver A260-målingen.

Formel for DNA-koncentration

Dobbeltstrenget DNA absorberer UV-lys proportionalt med sin koncentration, hvilket kaldes Beer-Lamberts lov. Ved en standard lysvej på 1 centimeter indeholder en opløsning med en A260-måling på 1,0 cirka 50 ng/µL dobbeltstrenget DNA. Dette tal, omregningsfaktoren, omdanner enhver A260-måling til en koncentration:

DNA-koncentration (ng/µL) = A260 × 50 × fortyndingsfaktor

Fortyndingsfaktoren tager højde for enhver fortynding, der er foretaget, før prøven blev målt. En prøve, der måles uden fortynding, har en fortyndingsfaktor på 1.

Sådan beregnes det samlede DNA-udbytte

Når koncentrationen er kendt, kan den samlede masse af DNA i prøven bestemmes ud fra dens volumen:

Samlet DNA (µg) = koncentration (ng/µL) × volumen (µL) ÷ 1000

Sådan beregnes DNA-koncentration: trin for trin

1. Bland prøven grundigt før målingen. DNA kan sætte sig fast på rørvæggene eller bundfælde ujævnt.
2. Fortynd prøven, hvis den er stærkt koncentreret, så A260-målingen ligger mellem 0,1 og 1,0. Spektrofotometermålinger er mindst pålidelige uden for dette interval.
3. Nulstil spektrofotometeret med den samme buffer, der blev brugt til fortyndingen, og mål derefter prøven ved 260 nm.
4. Indtast A260-målingen, prøvevolumen og fortyndingsfaktoren i beregneren for at få koncentrationen og det samlede udbytte. Alle tre felter skal udfyldes, og volumen skal være større end nul, før et resultat vises.

Gennemregnet eksempel

Eksempel 1: ufortyndet prøve

En A260-måling på 0,5, ingen fortynding (fortyndingsfaktor 1) og en prøvevolumen på 100 µL.

• Koncentration = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Samlet DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Eksempel 2: fortyndet prøve

Et rør indeholder 50 µL oprenset DNA. En lille del af det blev fortyndet 10 gange, og den fortyndede del gav en A260-måling på 0,75. Fortyndingsfaktoren omregner denne måling tilbage til koncentrationen i det oprindelige rør, og 50 µL er den volumen, der indtastes ved beregningen af det samlede udbytte.

• Koncentration = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Samlet DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Beregning af fortyndingsfaktoren

Fortyndingsfaktor = samlet volumen efter fortynding ÷ volumen af den oprindelige prøve.

Tilsætning af 5 µL DNA-opløsning til 45 µL buffer giver en samlet volumen på 50 µL, så fortyndingsfaktoren er 50 ÷ 5 = 10. En prøve, der ikke er blevet fortyndet, har en fortyndingsfaktor på 1.

Typiske koncentrationsintervaller for DNA

Koncentrationen afhænger af prøvetypen og ekstraktionsmetoden. Genomiske DNA-ekstraktioner ligger typisk mellem cirka 10 og 100 ng/µL. Plasmid-DNA-præparater giver ofte højere koncentrationer, undertiden flere hundrede ng/µL. Et resultat, der ligger langt uden for det forventede interval for en given metode, kan tyde på et problem med selve ekstraktionen eller målingen.

Begrænsninger ved måling af UV-absorbans

Måling af A260 er hurtig, men det er ikke den mest følsomme eller specifikke metode til DNA. Proteiner, RNA og visse bufferkomponenter absorberer også lys nær 260 nm og kan få målingen til at se højere ud. Forskere kontrollerer ofte A260/A280-forholdet sammen med koncentrationen for at screene for proteinkontaminering; et forhold nær 1,8 angiver normalt en ren DNA-prøve. Fluorescensbaserede metoder med farvestoffer, såsom Qubit-assays, binder kun til dobbeltstrenget DNA og giver en mere nøjagtig måling for fortyndede eller urene prøver, men de kræver ekstra reagenser og et fluorometer.

Ofte stillede spørgsmål

Hvordan beregnes DNA-koncentration ud fra A260?

Gang A260-målingen med 50, standardomregningsfaktoren for dobbeltstrenget DNA, og gang derefter med fortyndingsfaktoren. Hvis prøven ikke blev fortyndet, skal fortyndingsfaktoren 1 bruges.

Hvad er et godt A260/A280-forhold?

Et forhold nær 1,8 angiver normalt en ren DNA-prøve. Et lavere forhold tyder på proteinkontaminering. Et forhold over 2,0 kan tyde på RNA-kontaminering.

Kan denne beregner bruges til RNA?

Ikke direkte, fordi RNA bruger en omregningsfaktor på 40 ng/µL i stedet for 50. Hvis RNA-koncentrationen skal estimeres, ganges beregnerens resultat med 0,8 (40 ÷ 50), eller A260 × 40 × fortyndingsfaktor bruges direkte.

Hvorfor bør A260-målingen ligge mellem 0,1 og 1,0?

Absorbansen er omtrent proportional med koncentrationen, som beskrevet af Beer-Lamberts lov, hovedsageligt inden for dette interval. Uden for intervallet bliver målingerne mindre pålidelige, så en prøve, der er for koncentreret eller for fortyndet, bør fortyndes eller koncentreres, før den måles igen.

Hvad er forskellen mellem koncentration og renhed?

Koncentrationen angiver, hvor meget DNA der er til stede, i ng/µL. Renhed angiver, hvor ren prøven er, hvilket hovedsageligt vurderes ud fra absorbansforhold som A260/A280. En prøve kan have en høj koncentration og stadig være uren eller have en lav koncentration og være meget ren.

Hvordan omregnes ng/µL til µg/mL?

De to enheder er numerisk ens. 1 ng/µL er lig med 1 µg/mL, fordi både masseenheden og volumenheden skaleres med en faktor på 1000.

Referencer

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. udg.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Kvantificering af DNA og RNA med absorptions- og fluorescensspektroskopi. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Betydningen af A260/A280-forhold ved måling af nukleinsyrers renhed. BioTechniques, 19(2), 208–210.