Beregn DNA koncentration fra absorbansmålinger (A260) med justerbare fortyndingsfaktorer. Værktøj, der er essentielt for molekylærbiologiske laboratorier og genetisk forskning.
DNA-koncentrationen beregnes ved hjælp af følgende formel:
En DNA koncentrationsberegner er et essentielt online værktøj, der hjælper molekylærbiologer, genetikere og laboratorieteknikere med præcist at bestemme DNA-koncentration fra spektrofotometriske målinger. Denne gratis beregner bruger den standard A260 metode til at konvertere UV-absorptionsmålinger til præcise DNA-koncentrationsværdier i ng/μL.
DNA koncentrationsmåling er en grundlæggende procedure i molekylærbiologiske laboratorier, der fungerer som et kritisk kvalitetskontroltrin før PCR, sekventering, kloning og andre molekylære teknikker. Vores beregner eliminerer manuelle beregninger og reducerer fejl, når der bestemmes både koncentration og totale DNA-mængder i dine prøver.
Beregning af DNA-koncentration er baseret på Beer-Lambert loven, som angiver, at absorbansen af en opløsning er direkte proportional med koncentrationen af de absorberende arter i opløsningen og lysstrækningen gennem opløsningen. For dobbeltstrenget DNA svarer en absorbans på 1.0 ved 260nm (A260) i en 1cm lysstrækning cuvette til en koncentration på cirka 50 ng/μL.
DNA-koncentrationen beregnes ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
Den totale mængde DNA i prøven kan derefter beregnes ved:
Absorbans ved 260nm (A260):
Konverteringsfaktor (50):
Fortyndingsfaktor:
Volumen:
Følg denne enkle proces for at beregne DNA koncentration fra dine A260 målinger:
DNA koncentrationsmåling er essentiel for adskillige molekylærbiologiske og forskningsapplikationer:
Før ligering af DNA-fragmenter i vektorer, tillader kendskab til den nøjagtige koncentration forskere at beregne det optimale insert-til-vektor-forhold, hvilket maksimerer transformations effektiviteten. For eksempel giver et 3:1 molarforhold af insert til vektor ofte de bedste resultater, hvilket kræver præcise koncentrationsmålinger af begge komponenter.
PCR-reaktioner kræver typisk 1-10 ng af template DNA for optimal amplifikation. For lidt DNA kan resultere i amplifikationsfejl, mens for meget kan hæmme reaktionen. For kvantitativ PCR (qPCR) er endnu mere præcis DNA kvantificering nødvendig for at sikre nøjagtige standardkurver og pålidelig kvantificering.
NGS-biblioteksforberedelsesprotokoller specificerer nøjagtige DNA-inputmængder, ofte i området 1-500 ng afhængigt af platformen og applikationen. Nøjagtig koncentrationsmåling er essentiel for succesfuld biblioteksforberedelse og balanceret repræsentation af prøver i multiplex sekventeringskørsler.
Når DNA introduceres i eukaryote celler, varierer den optimale DNA-mængde afhængigt af celletype og transfektionsmetode. Typisk bruges 0.5-5 μg plasmid DNA pr. brønd i et 6-brønds pladeformat, hvilket kræver præcise koncentrationsmålinger for at standardisere eksperimenter.
I retsmedicinske applikationer er DNA-prøver ofte begrænsede og dyrebare. Nøjagtig kvantificering gør det muligt for retsmedicinske forskere at bestemme, om der er tilstrækkeligt DNA til profilering og at standardisere mængden af DNA, der bruges i efterfølgende analyser.
Restriktionsenzymer har specifikke aktivitetsenheder defineret pr. μg DNA. At kende den nøjagtige DNA-koncentration muliggør korrekte enzym-til-DNA-forhold, hvilket sikrer fuldstændig nedbrydning uden stjerneaktivitet (uspecifik klipning).
Selvom UV-spektrofotometri er den mest almindelige metode til DNA-kvantificering, findes der flere alternativer:
Fluorometriske Metoder:
Agarose Gel Elektrophorese:
Real-Time PCR:
Digital PCR:
Evnen til præcist at måle DNA-koncentration har udviklet sig betydeligt i takt med fremskridt inden for molekylærbiologi:
Efter opdagelsen af DNA's struktur af Watson og Crick i 1953 begyndte forskere at udvikle metoder til at isolere og kvantificere DNA. Tidlige tilgange var baseret på kolorimetriske assays som diphenylamine reaktionen, som producerede en blå farve, når den reagerede med deoxyribose sukkerarter i DNA. Disse metoder var relativt ufølsomme og tilbøjelige til interferens.
Anvendelsen af UV-spektrofotometri til kvantificering af nukleinsyrer blev udbredt i 1970'erne. Forskere opdagede, at DNA absorberede UV-lys med en maksimum ved 260nm, og at forholdet mellem absorbans og koncentration var lineært inden for et bestemt område. Konverteringsfaktoren på 50 ng/μL for dobbeltstrenget DNA ved A260 = 1.0 blev etableret i denne periode.
Udviklingen af DNA-specifikke fluorescerende farvestoffer i 1980'erne og 1990'erne revolutionerede DNA-kvantificering, især for fortyndede prøver. Hoechst farvestoffer og senere PicoGreen muliggavede meget mere følsom detektion end hvad der var muligt med spektrofotometri. Disse metoder blev særligt vigtige med fremkomsten af PCR, som ofte krævede præcis kvantificering af minut DNA-mængder.
Introduktionen af mikrovolumen spektrofotometre som NanoDrop i begyndelsen af 2000'erne transformerede rutinemæssig DNA-kvantificering ved kun at kræve 0.5-2 μL af prøven. Denne teknologi eliminerede behovet for fortyndinger og cuvetter, hvilket gjorde processen hurtigere og mere bekvem.
I dag har avancerede teknikker som digital PCR og next-generation sequencing skubbet grænserne for DNA-kvantificering endnu længere, hvilket muliggør absolut kvantificering af specifikke sekvenser og enkeltmolekyle detektion. Dog forbliver det grundlæggende spektrofotometriske princip, der blev etableret for årtier siden, ryggraden i rutinemæssig DNA-koncentrationsmåling i laboratorier verden over.
Lad os gennemgå nogle praktiske eksempler på DNA-koncentrationsberegninger:
En forsker har renset et plasmid og opnået følgende målinger:
Beregning:
Efter at have ekstraheret genomisk DNA fra blod:
Beregning:
Et sekventeringsprotokol kræver præcist 500 ng DNA:
Nødvendigt volumen = 500 ÷ 125 = 4 μL af DNA-opløsning
Her er eksempler på, hvordan man beregner DNA-koncentration i forskellige programmeringssprog:
1' Excel formel for DNA koncentration
2=A260*50*Fortyndingsfaktor
3
4' Excel formel for total DNA-mængde i μg
5=(A260*50*Fortyndingsfaktor*Volumen)/1000
6
7' Eksempel i en celle med A260=0.5, Fortyndingsfaktor=2, Volumen=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Resultat: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Beregn DNA koncentration i ng/μL
4
5 Parametre:
6 absorbance (float): Absorbansmåling ved 260nm
7
8 Returnerer:
9 float: DNA koncentration i ng/μL
10 """
11 return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14 """
15 Beregn total DNA-mængde i μg
16
17 Parametre:
18 concentration (float): DNA koncentration i ng/μL
19 volume_ul (float): Volumen af DNA-opløsning i μL
20
21 Returnerer:
22 float: Total DNA-mængde i μg
23 """
24 return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# Eksempel brug
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"DNA Koncentration: {concentration:.2f} ng/μL")
35print(f"Total DNA: {total_dna:.2f} μg")
361function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2 // Returnerer DNA koncentration i ng/μL
3 return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7 // Returnerer total DNA-mængde i μg
8 return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Eksempel brug
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA Koncentration: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Total DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21public class DNACalculator { /** * Beregn DNA koncentration i ng/μL * * @param absorbance Absorbansmåling ved 260nm * @param dilutionFactor Fortyndingsfaktor for prøven * @return DNA koncentration i ng/μL */ public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) { return absorbance * 50 * dilutionFactor; } /** * Beregn total DNA-mængde i μg * * @param concentration DNA koncentration i ng
Opdag flere værktøjer, der måske kan være nyttige for din arbejdsgang.