DNA Ligation Calculator

Introduktion

DNA-ligation er en kritisk teknik inden for molekylærbiologi, der bruges til at sammenføje DNA-fragmenter med kovalente bindinger. DNA Ligation Calculator er et vigtigt værktøj for forskere, der hjælper med at bestemme de optimale mængder af vektor- og indsætnings-DNA, der er nødvendige for succesfulde ligationsreaktioner. Ved at beregne de korrekte molære forhold mellem vektor (plasmid) og indsætnings-DNA-fragmenter sikrer denne beregner effektive molekylære kloningseksperimenter, samtidig med at spildte reagenser og mislykkede reaktioner minimeres.

Ligationreaktioner er fundamentale for genetisk engineering, syntetisk biologi og molekylære kloningsprocedurer. De gør det muligt for forskere at skabe rekombinante DNA-molekyler ved at indsætte gener af interesse i plasmidvektorer til efterfølgende transformation i værtsorganismer. Succesen af disse reaktioner afhænger i høj grad af brugen af de passende mængder DNA-komponenter, hvilket netop er, hvad denne beregner hjælper med at bestemme.

Uanset om du konstruerer ekspressionsvektorer, opretter genbiblioteker eller udfører rutinemæssig subkloning, vil denne DNA-ligation beregner hjælpe dig med at optimere dine eksperimentelle betingelser og øge din succesrate. Ved at indtaste et par nøgleparametre om dine DNA-prøver kan du hurtigt få de nøjagtige volumener, der er nødvendige for din specifikke ligationsreaktion.

Formel/Beregning

DNA-ligation beregneren bruger en grundlæggende molekylærbiologisk formel, der tager højde for de forskellige størrelser og koncentrationer af de DNA-fragmenter, der skal sammenføjes. Den primære beregning bestemmer, hvor meget indsætnings-DNA der er nødvendigt i forhold til vektor-DNA baseret på deres respektive længder og det ønskede molære forhold.

Beregning af indsætningsmængde

Mængden af indsætnings-DNA, der er nødvendig (i nanogram), beregnes ved hjælp af følgende formel:

$\text{ng af indsæt} = \text{ng af vektor} \times \frac{\text{kb størrelse af indsæt}}{\text{kb størrelse af vektor}} \times \text{molært forhold}$

Hvor:

• ng af vektor = mængden af vektor-DNA, der anvendes i reaktionen (typisk 50-100 ng)
• kb størrelse af indsæt = længden af indsætnings-DNA-fragmentet i kilobaser (kb)
• kb størrelse af vektor = længden af vektor-DNA i kilobaser (kb)
• molært forhold = ønsket forhold mellem indsætningsmolekyler og vektormolekyler (typisk 3:1 til 5:1)

Volumenberegninger

Når den krævede mængde indsætnings-DNA er bestemt, beregnes de nødvendige volumener til reaktionen:

$\text{Vektorvolumen (μL)} = \frac{\text{ng af vektor}}{\text{vektor koncentration (ng/μL)}}$

$\text{Indsætsvolumen (μL)} = \frac{\text{ng af indsæt}}{\text{indsæts koncentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/vand volumen (μL)} = \text{Total reaktionsvolumen (μL)} - \text{Vektorvolumen (μL)} - \text{Indsætsvolumen (μL)}$

Eksempelberegning

Lad os arbejde igennem et praktisk eksempel:

• Vektor koncentration: 50 ng/μL
• Vektor længde: 3000 bp (3 kb)
• Indsæts koncentration: 25 ng/μL
• Indsæts længde: 1000 bp (1 kb)
• Ønsket molært forhold (indsæt:vektor): 3:1
• Total reaktionsvolumen: 20 μL
• Vektormængde at bruge: 50 ng

Trin 1: Beregn den krævede indsætsmængde $\text{ng af indsæt} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Trin 2: Beregn volumenerne $\text{Vektorvolumen} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Indsætsvolumen} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/vand volumen} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Denne beregning sikrer, at der er tre indsætmolekyler for hver vektormolekyle i reaktionen, hvilket optimerer chancerne for succesfuld ligation.

Trin-for-trin guide til brug af beregneren

Vores DNA Ligation Calculator er designet til at være intuitiv og ligetil. Følg disse trin for at beregne de optimale volumener til din ligationsreaktion:

1. Indtast vektoroplysninger:

   • Indtast din vektor koncentration i ng/μL
   • Indtast vektorens længde i basepar (bp)
   • Angiv mængden af vektor-DNA, du ønsker at bruge i reaktionen (ng)

2. Indtast indsætsoplysninger:

   • Indtast din indsæts koncentration i ng/μL
   • Indtast indsættets længde i basepar (bp)

3. Indstil reaktionsparametre:

   • Angiv det ønskede molære forhold (indsæt:vektor) - typisk mellem 3:1 og 5:1
   • Indtast det totale reaktionsvolumen i μL (normalt 10-20 μL)

4. Se resultater:

   • Beregneren viser automatisk:
     • Nødvendigt vektorvolumen (μL)
     • Nødvendigt indsætsvolumen (μL)
     • Buffer/vand volumen at tilsætte (μL)
     • Total reaktionsvolumen (μL)
     • Mængden af vektor og indsæts-DNA i reaktionen (ng)

5. Kopier resultater (valgfrit):

   • Brug knappen "Kopier resultater" til at kopiere alle beregninger til din udklipsholder til dit laboratoriumsnotat eller protokoller

Beregneren udfører valideringskontroller for at sikre, at alle indtastninger er positive tal, og at det samlede volumen er tilstrækkeligt til de krævede DNA-volumener. Hvis der opdages fejl, vil nyttige fejloplysninger guide dig til at rette indtastningerne.

Anvendelsesscenarier

DNA Ligation Calculator er værdifuld på tværs af mange molekylærbiologiske anvendelser:

Molekylær kloning

Den mest almindelige anvendelse er standard molekylær kloning, hvor forskere indsætter gener eller DNA-fragmenter i plasmidvektorer. Beregneren sikrer optimale betingelser for:

• Subkloning af gener mellem forskellige ekspressionsvektorer
• Oprettelse af fusionsproteiner ved at sammenføje flere genfragmenter
• Konstruktion af reporter-genassays
• Bygning af plasmidbiblioteker

Syntetisk biologi

I syntetisk biologi, hvor flere DNA-fragmenter ofte samles:

• Gibson Assembly-reaktioner drager fordel af præcise indsæts:vektor-forhold
• Golden Gate assembliesystemer kræver specifikke DNA-koncentrationer
• BioBrick-samling af standardiserede genetiske dele
• Konstruktion af syntetiske genetiske kredsløb

Udvikling af diagnostiske sæt

Når der udvikles molekylære diagnostiske værktøjer:

• Kloning af sygdomsspecifikke genetiske markører
• Konstruktion af positive kontrolplasmider
• Udvikling af kalibreringsstandarder til qPCR

Protein expressionssystemer

For forskere, der arbejder med proteinproduktion:

• Optimering af indsæts:vektor-forhold for høj-kopi ekspressionsvektorer
• Konstruktion af inducerbare ekspressionssystemer
• Oprettelse af sekretionsvektorer til proteinrensning

CRISPR-Cas9-applikationer

I genredigeringsapplikationer:

• Kloning af guide-RNA'er i CRISPR-vektorer
• Oprettelse af donor-templater til homolog reparation
• Bygning af biblioteker af guide-RNA'er til screening

Udfordrende ligationer

Beregneren er særligt værdifuld for udfordrende ligationsscenarier:

• Kloning af store indsæt (>5 kb)
• Meget små fragmentindsættelser (<100 bp)
• Blunt-end ligationer, der har lavere effektivitet
• Multi-fragment samlingsreaktioner

Alternativer

Mens vores DNA Ligation Calculator giver præcise beregninger for traditionelle ligationsreaktioner, findes der flere alternative tilgange til at sammenføje DNA-fragmenter:

1. Gibson Assembly: Bruger exonuklease, polymerase og ligase i en enkelt reaktionsrør til at sammenføje overlappende DNA-fragmenter. Ingen traditionelle ligationsberegninger er nødvendige, men koncentrationsforhold er stadig vigtige.

2. Golden Gate Assembly: Bruger Type IIS restriktionsenzymer til retningsbestemt, scarless samling af flere fragmenter. Kræver ækvimolære mængder af alle fragmenter.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Bruger exonuklease til at skabe enkeltstrenget overhæng, der annealer sammen. Typisk bruger ækvimolære forhold af fragmenter.

4. In-Fusion Cloning: Kommercielt system, der tillader sammenføjning af fragmenter med 15 bp overlap. Bruger et specifikt forhold baseret på fragmentstørrelser.

5. Gateway Cloning: Bruger sitespecifik recombination i stedet for ligation. Kræver specifikke indgangs- og destinationsvektorer.

6. Empirisk testning: Nogle laboratorier foretrækker at opsætte flere ligationsreaktioner med forskellige indsæts:vektor-forhold (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) og bestemme, hvilken der fungerer bedst for deres specifikke konstruktioner.

7. Softwareberegnere: Kommercielle softwarepakker som Vector NTI og SnapGene inkluderer ligationsberegnere med yderligere funktioner som restriktionsstedsanalyse.

Historie

Udviklingen af DNA-ligation beregninger følger parallelt med udviklingen af molekylære kloningsteknikker, som har revolutioneret molekylærbiologi og bioteknologi.

Tidlige udviklinger (1970'erne)

Konceptet om DNA-ligation til molekylær kloning opstod i begyndelsen af 1970'erne med det banebrydende arbejde af Paul Berg, Herbert Boyer og Stanley Cohen, der udviklede de første rekombinante DNA-molekyler. I denne periode var ligationsreaktioner stort set empiriske, hvor forskere brugte trial and error til at bestemme optimale betingelser.

Opdagelsen af restriktionsenzymer og DNA-ligase gav de essentielle værktøjer til at skære og genforene DNA-molekyler. T4 DNA-ligase, isoleret fra T4-bakteriofag-inficerede E. coli, blev den standardenzyme til at sammenføje DNA-fragmenter på grund af dens evne til at ligere både blunt og sammenhængende ender.

Forfiningsperiode (1980'erne-1990'erne)

Efterhånden som molekylær kloning blev mere rutinemæssig, begyndte forskere at udvikle mere systematiske tilgange til ligationsreaktioner. Vigtigheden af molære forhold mellem vektor og indsætnings-DNA blev tydelig, hvilket førte til udviklingen af den grundlæggende formel, der stadig bruges i dag.

I denne periode etablerede forskere, at overskydende indsætnings-DNA (typisk 3:1 til 5:1 molært forhold af indsæt til vektor) generelt forbedrede ligationseffektiviteten for standard kloningapplikationer. Denne viden blev oprindeligt delt gennem laboratorieprotokoller og fandt gradvist vej ind i molekylærbiologiske manualer og lærebøger.

Moderne æra (2000'erne-nu)

Fremkomsten af computerbaserede værktøjer og onlineberegnere i 2000'erne gjorde præcise ligationsberegninger mere tilgængelige for forskere. Efterhånden som molekylærbiologiske teknikker blev mere sofistikerede, blev behovet for nøjagtige beregninger mere kritisk, især for udfordrende kloningsprojekter, der involverer flere fragmenter eller store indsæt.

I dag er DNA-ligation beregninger en integreret del af molekylære kloningsarbejdsgange, med dedikerede beregnere som denne, der hjælper forskere med at optimere deres eksperimenter. Den grundlæggende formel er forblevet stort set uændret, selvom vores forståelse af de faktorer, der påvirker ligationseffektivitet, er forbedret.

Fremkomsten af alternative kloningsmetoder som Gibson Assembly og Golden Gate kloning har introduceret nye beregningsbehov, men det grundlæggende koncept om molære forhold mellem DNA-fragmenter forbliver vigtigt på tværs af disse teknikker.

Kodeeksempler

Her er implementeringer af DNA-ligation beregneren i forskellige programmeringssprog:

1' Excel VBA-funktion til DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Beregn den nødvendige indsætsmængde i ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Beregn vektorvolumen i μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Beregn indsætsvolumen i μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Beregn buffer/vand volumen i μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Brugseksempel i en celle:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Beregn volumener til en DNA-ligationreaktion.
5    
6    Parametre:
7    vector_concentration (float): Koncentration af vektor-DNA i ng/μL
8    vector_length (float): Længde af vektor-DNA i basepar
9    insert_concentration (float): Koncentration af indsætnings-DNA i ng/μL
10    insert_length (float): Længde af indsætnings-DNA i basepar
11    molar_ratio (float): Ønsket molært forhold mellem indsæt:vektor
12    total_volume (float): Total reaktionsvolumen i μL
13    vector_amount (float): Mængde af vektor-DNA at bruge i ng (standard: 50)
14    
15    Returnerer:
16    dict: Ordbog, der indeholder beregnede volumener og mængder
17    """
18    # Beregn vektorvolumen
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Beregn den nødvendige indsætsmængde
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Beregn indsætsvolumen
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Beregn buffer/vand volumen
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Eksempel på brug
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Indsæt: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Konverter længder til kb for beregning
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Beregn den nødvendige indsætsmængde
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Beregn volumener
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Eksempel på brug
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Indsæt: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Konverter længder til kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Beregn den nødvendige indsætsmængde
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Beregn volumener
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Rund til 2 decimaler
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Indsæt: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Konverter længder til kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Beregn den nødvendige indsætsmængde
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Beregn volumener
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Rund til 2 decimaler
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Indsæt: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Ofte stillede spørgsmål (FAQ)

Hvad er det optimale molære forhold for DNA-ligation?

Det optimale molære forhold mellem indsæt og vektor ligger typisk mellem 3:1 og 5:1 for standard kloningapplikationer. Dette kan dog variere afhængigt af den specifikke ligationsscenarie:

• For blunt-end ligationer: 3:1 til 5:1
• For sticky-end ligationer: 1:1 til 3:1
• For store indsæt (>10 kb): 1:1 til 2:1
• For små indsæt (<500 bp): 5:1 til 10:1
• For multi-fragment assembly: 3:1 for hver indsæt til vektor

Hvorfor mislykkes min ligationsreaktion trods brug af de beregnede volumener?

Flere faktorer kan påvirke ligationseffektiviteten ud over det molære forhold:

1. DNA-kvalitet: Sørg for, at både vektor og indsæt har rene ender uden skader
2. Dephosphorylering: Tjek om din vektor blev dephosphoryleret, hvilket forhindrer selv-ligation
3. Enzymaktivitet: Bekræft, at din ligase er aktiv og anvendt ved den korrekte temperatur
4. Inkubationstid: Nogle ligationer drager fordel af længere inkubation (overnatning ved 16°C)
5. Bufferbetingelser: Sørg for, at den korrekte buffer med ATP anvendes
6. Forurenende stoffer: Rens DNA for at fjerne hæmmere som EDTA eller høj salt

Hvor meget vektor-DNA skal jeg bruge i en ligationsreaktion?

Typisk anbefales 50-100 ng vektor-DNA til standard ligationsreaktioner. At bruge for meget vektor kan føre til højere baggrund af uklippet eller selv-ligeret vektor, mens for lidt kan reducere transformations effektiviteten. For udfordrende ligationer kan det være nødvendigt at optimere denne mængde.

Skal jeg justere beregningerne for blunt-end versus sticky-end ligationer?

Ja. Blunt-end ligationer er generelt mindre effektive end sticky-end (sammenhængende ender) ligationer. For blunt-end ligationer skal du bruge:

• Højere molære forhold (3:1 til 5:1 eller endda højere)
• Mere T4 DNA-ligase (typisk 2-3 gange mere)
• Længere inkubationstider
• Overvej at tilsætte PEG for at forbedre ligationseffektiviteten

Hvordan beregner jeg ligation for flere indsæt?

For samling af flere fragmenter:

1. Beregn hver indsætsmængde individuelt ved hjælp af den samme formel
2. Oprethold det samme samlede molære forhold (f.eks. for to indsæt, brug 1.5:1.5:1 indsæt1:indsæt2:vektor)
3. Juster det totale reaktionsvolumen for at imødekomme alle DNA-fragmenter
4. Overvej sekventiel ligation eller brug af samlingsmetoder som Gibson Assembly for flere fragmenter

Kan jeg bruge denne beregner til Gibson Assembly eller Golden Gate Assembly?

Denne beregner er specifikt designet til traditionelle restriktionsenzym- og ligase-baserede kloning. For Gibson Assembly anbefales ækvimolære mængder af alle fragmenter typisk (1:1 forhold), selvom den grundlæggende beregning af DNA-mængde baseret på længde er lignende. For Golden Gate Assembly bruges der også ækvimolære forhold af alle komponenter.

Hvordan tager jeg højde for vektor dephosphorylering i mine beregninger?

Dephosphorylering af vektoren (fjernelse af 5' fosfatgrupper) forhindrer selv-ligation, men ændrer ikke mængdeberegningerne. For dephosphorylerede vektorer:

1. Brug friske indsæts-DNA med intakte 5' fosfater
2. Overvej at bruge lidt højere indsæts:vektor-forhold (4:1 til 6:1)
3. Sørg for længere ligationstid (mindst 1 time ved stuetemperatur eller over natten ved 16°C)

Hvad er det mindste totale reaktionsvolumen, jeg bør bruge?

Det mindste praktiske reaktionsvolumen er typisk 10 μL, hvilket tillader tilstrækkelig blanding og forhindrer fordampningsproblemer. Hvis dine beregnede DNA-volumener overstiger det ønskede reaktionsvolumen, har du flere muligheder:

1. Brug mere koncentrerede DNA-prøver
2. Skaler ned mængden af vektor, der anvendes (f.eks. 25 ng i stedet for 50 ng)
3. Øg det totale reaktionsvolumen
4. Overvej at koncentrere dine DNA-prøver

Hvor lang tid skal jeg inkubere min ligationsreaktion?

Optimale inkubationstider varierer afhængigt af ligationstypen:

• Sticky-end ligationer: 1 time ved stuetemperatur (22-25°C) eller 4-16 timer ved 16°C
• Blunt-end ligationer: 2-4 timer ved stuetemperatur eller over natten (12-16 timer) ved 16°C
• Hurtige ligationer (ved brug af højkoncentrations ligase): 5-15 minutter ved stuetemperatur

Kan jeg genbruge resterende ligationsreaktion til transformation?

Ja, ligationsblandinger kan typisk opbevares ved -20°C og genbruges til transformation. Hver fryse-tø cyklus kan dog reducere effektiviteten. For de bedste resultater:

1. Aliquoter ligationsblandingen før fryseren
2. Varmeinaktiver ligasen (65°C i 10 minutter) før opbevaring
3. Brug inden for 1-2 måneder for optimale resultater

Referencer

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. udg.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. udg.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/