DNA Ligations Beregner - Beregn Indsats:Vektor Forhold til Molekylær Kloning

DNA-ligering er det trin i molekylær kloning, hvor et insertfragment forbindes med en plasmidvektor ved hjælp af enzymet T4-DNA-ligase. En beregner til DNA-ligering beregner, hvor mange mikroliter insert-DNA og vektor-DNA der skal blandes, så reaktionen når et valgt molært forhold mellem insert og vektor.

Hvad beregneren gør

Beregneren bruger seks inputværdier: vektorkoncentration, vektorlængde, insertkoncentration, insertlængde, det ønskede molforhold mellem insert og vektor samt det samlede reaktionsvolumen. Den giver også mulighed for at angive, hvor meget vektor-DNA der skal bruges; standardværdien er 50 nanogram (ng). Ud fra disse værdier beregner den vektorvolumenet, der skal pipetteres, insertvolumenet, der skal pipetteres, og hvor meget buffer eller vand der skal tilsættes for at nå det samlede reaktionsvolumen.

Koncentrationen måles i nanogram pr. mikroliter (ng/μL) og aflæses normalt på et Nanodrop- eller Qubit-instrument. Længden måles i basepar (bp). Én kilobase (kb) svarer til 1000 basepar. Det molære forhold angiver, hvor mange insertmolekyler der skal være for hvert vektormolekyle. Det er ikke et masseforhold.

Hvorfor der bruges et molært forhold og ikke et masseforhold

Lige masser DNA indeholder ikke lige mange molekyler. Et kort DNA-fragment vejer mindre end en lang vektor med samme antal molekyler. Hvis man blander lige store mængder i nanogram af et kort DNA-fragment og en lang vektor, vil der være alt for få insertmolekyler i forhold til vektormolekylerne. Beregneren skalerer insertmassen efter forholdet mellem fragmenternes længder, så den endelige blanding har det ønskede antal insertmolekyler pr. vektormolekyle.

Formel for DNA-ligering

Den nødvendige mængde insert-DNA i nanogram er:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

hvor $m_i$ er mængden af insert-DNA i nanogram, $m_v$ er mængden af vektor i nanogram, $k_i$ er længden af insertet i kilobaser, $k_v$ er vektorlængden i kilobaser, og R er det ønskede molære forhold mellem insert og vektor.

Når denne mængde er kendt, omregner beregneren hver mængde til et volumen, der kan pipetteres:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

hvor $V_v$ og $V_i$ er vektor- og insertvolumenerne i mikroliter, $c_v$ og $c_i$ er vektor- og insertkoncentrationerne i nanogram pr. mikroliter, $V_b$ er buffervolumenet, og $V_t$ er det samlede reaktionsvolumen.

Hvis vektor- og insertvolumenerne tilsammen er større end det samlede reaktionsvolumen, er der ikke plads tilbage til buffer, ligase eller vand. I så fald angiver beregneren, at det samlede volumen er for lille, i stedet for at vise en negativ buffermængde.

Regneeksempel

En forsker kloner et genfragment på 1 kb ind i en plasmidvektor på 3 kb. Planen er at bruge 50 ng vektor-DNA ved et molært insert:vektor-forhold på 3:1 i en reaktion på 20 μL.

Inputværdier:

• Vektorkoncentration: 50 ng/μL
• Vektorlængde: 3000 bp (3 kb)
• Insertkoncentration: 25 ng/μL
• Insertlængde: 1000 bp (1 kb)
• Molært forhold: 3
• Samlet volumen: 20 μL
• Vektormængde: 50 ng

Trin 1: insertmængde

ng insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Trin 2: volumener

Vektorvolumen = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertvolumen = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Buffervolumen = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaktionen består af 1 μL vektor, 2 μL insert og 17 μL buffer eller vand, som også er det sted, hvor ligasen og dens reaktionsbuffer tilsættes. Denne blanding giver tre insertmolekyler for hvert vektormolekyle.

Typiske molære forhold ved ligering

Ved de fleste standardkloninger med klæbrige, overhængende ender anvendes et insert:vektor-forhold på 3:1. Ligeringsreaktioner, hvor stumpe ender sammenføjes, er mindre effektive, så et højere forhold, f.eks. 5:1, er almindeligt. Meget store inserts fungerer undertiden bedre ved et lavere forhold tættere på 1:1, eftersom store fragmenter allerede bidrager med mange basepar pr. molekyle.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er DNA-ligering?

DNA-ligering er sammenføjningen af to DNA-fragmenter, typisk en plasmidvektor og et insertfragment, til ét sammenhængende molekyle. Enzymet T4-DNA-ligase forsegler forbindelsen mellem fragmenternes ender.

Hvad betyder det molære insert:vektor-forhold?

Det er antallet af insert-DNA-molekyler for hvert vektormolekyle i reaktionen. Et forhold på 3:1 betyder tre insertmolekyler for hvert vektormolekyle, uanset hvordan deres masser forholder sig til hinanden.

Hvorfor bruges der ikke lige store mængder vektor og insert i nanogram?

DNA-fragmenter med forskellig længde har forskellig masse pr. molekyle. Et insertfragment på 1 kb vejer omtrent en tredjedel så meget som en vektor på 3 kb, molekyle for molekyle. Lige store mængder i nanogram ville ikke give lige mange molekyler, så beregneren justerer insertmassen, så den passer til det ønskede molære forhold.

Hvad betyder det, hvis det samlede volumen er for lille?

Det betyder, at vektor- og insertvolumenerne tilsammen optager hele reaktionsvolumenet, så der ikke er plads til buffer eller ligase. Løsningen er at øge det samlede reaktionsvolumen eller bruge mere koncentrerede DNA-opløsninger.

Kan denne beregner bruges til Gibson Assembly- eller Golden Gate-kloning?

Nej. Disse metoder anvender en anden reaktionskemi og sigter normalt mod ækvimolære mængder af alle fragmenter i stedet for et fast forhold mellem insert og vektor. Volumenberegningerne adskiller sig fra standardkloning med T4-ligase.

Hvor meget vektor-DNA bruges typisk?

50 ng er en almindelig startmængde til en standard ligeringsreaktion. Laboratorier bruger også mængder fra 25 til 100 ng, justeret efter DNA-koncentrationen og reaktionens skala.