BCA Probenvolumen-Rechner | Protein-Quantifizierungstool

Was ist ein BCA-Probenvolumenrechner

Ein BCA-Probenvolumenrechner wandelt einen Absorbanzmesswert aus einem BCA-Proteintest in das Probenvolumen in Mikrolitern (μL) um, das benötigt wird, um eine festgelegte Proteinmenge aufzutragen. Er wird nach der Durchführung eines Bicinchoninsäure-(BCA-)Proteintests verwendet, eines gängigen Labortests, der anhand der Menge des violetten, lichtabsorbierenden Farbstoffs bestimmt, wie viel Protein in einer Lösung enthalten ist.

Wie der BCA-Test Protein misst

Der BCA-Test verläuft in zwei Schritten. Zuerst reduziert Protein in der Probe in alkalischer Lösung Kupferionen (Cu²⁺) zu einer anderen Form (Cu¹⁺). Das Ausmaß der Reduktion hängt davon ab, wie viel Protein vorhanden ist. Danach bindet Bicinchoninsäure das reduzierte Kupfer und bildet eine violette Verbindung, die Licht bei einer Wellenlänge von 562 Nanometern (nm) stark absorbiert.

Ein Spektrophotometer misst, wie viel Licht die Probe bei 562 nm absorbiert. Dieser Wert wird als Absorbanz bezeichnet. Eine dunklere violette Färbung bedeutet eine höhere Absorbanz und mehr Protein. Im Labor wird die Absorbanz jeder Probe mit einer Standardkurve verglichen, die durch die Messung bekannter Konzentrationen eines Referenzproteins, meist Rinderserumalbumin (BSA), erstellt wird.

BCA ist beliebt, weil es auch funktioniert, wenn eine Probe Detergenzien enthält, also Chemikalien, die in Zelllysepuffern üblich sind. Das Micro-BCA-Kit nennt zum Beispiel SDS und Triton X-100 als verträglich bis 5 %. Die meisten Detergenzien stören den Bradford-Test, eine ältere farbstoffbasierte Methode.

Formel zur Umrechnung von BCA-Absorbanz in Probenvolumen

Eine BCA-Standardkurve ist eine als Gerade angepasste Beziehung zwischen Absorbanz und Konzentration:

$\text{Absorbanz} = \text{Steigung} \times \text{Konzentration} + \text{Achsenabschnitt}$

Für die umgekehrte Berechnung, also von einer gemessenen Absorbanz zurück zur Proteinkonzentration, wird die Gleichung umgestellt:

$\text{Proteinkonzentration (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbanz} - \text{Achsenabschnitt}}{\text{Steigung}}$

Sobald die Konzentration bekannt ist, ergibt sich das Probenvolumen, das eine bestimmte Proteinmasse enthält, aus:

$\text{Probenvolumen (μL)} = \frac{\text{Probenmasse (μg)}}{\text{Proteinkonzentration (μg/μL)}}$

Der Rechner bietet vier voreingestellte Kurventypen mit jeweils eigener Steigung und eigenem Achsenabschnitt. Der Achsenabschnitt beträgt bei jeder Voreinstellung 0, weil die Messwerte um den Leerwert korrigiert werden (zuerst wird die Absorbanz einer proteinfreien Kontrolle abgezogen). Die Steigung zeigt, welchen Anteil des Absorbanzbereichs der Platte der Arbeitsbereich des jeweiligen Protokolls abdeckt.

Die Bereiche Standard und Enhanced stammen aus dem Handbuch zum Pierce-BCA-Kit. Der Micro-Bereich stammt aus dem Handbuch zum Micro-BCA-Kit.

Ein empfindlicheres Protokoll für verdünnte Proben erzeugt pro Mikrogramm Protein eine höhere Absorbanz und hat daher eine größere Steigung. Enhanced-BCA und Micro-BCA sind für Proben vorgesehen, die für eine genaue Messung mit dem Standardprotokoll zu verdünnt sind.

Berechnung des Probenvolumens aus der BCA-Absorbanz

1. Führen Sie den BCA-Test durch und messen Sie für jede Probe die Absorbanz bei 562 nm.
2. Wählen Sie den Kurventyp, der dem verwendeten Protokoll entspricht (Standard, Enhanced oder Micro), oder geben Sie eine benutzerdefinierte Steigung und einen Achsenabschnitt aus einer an diesem Tag erstellten Kurve ein.
3. Geben Sie für jede Probe den Absorbanzmesswert und die Zielproteinmasse in Mikrogramm ein.
4. Der Rechner wandelt die Absorbanz in eine Proteinkonzentration um und teilt anschließend die Zielmasse durch diese Konzentration, um das zu pipettierende Volumen zu bestimmen.

Beispiel: Berechnung des Probenvolumens aus der BCA-Absorption

Eine Forschende, die einen Western Blot vorbereitet, benötigt 20 μg Protein pro Spur und verwendet die Standard-BCA-Kurve (Steigung 1,0, Achsenabschnitt 0).

Probe A weist eine Absorption von 0,75 auf:

• Proteinkonzentration = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Probenvolumen = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Probe B weist eine Absorption von 1,2 auf:

• Proteinkonzentration = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Probenvolumen = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Probe A ist stärker verdünnt, daher ist ein größeres Volumen erforderlich, um dieselbe Zielmenge von 20 μg zu erreichen.

Ergebnisse des Rechners verstehen

Der Rechner gibt für jede Probe zwei Werte aus: die Proteinkonzentration in μg/μL und das Probenvolumen in μL. Außerdem kennzeichnet er Ergebnisse, die wahrscheinlich Probleme verursachen:

• Eine Absorption über 3,0 löst eine Warnung aus, da typische BCA-Messwerte zwischen 0 und 2,0 liegen.
• Eine Absorption unter 0,05, aber über null, löst eine Warnung aus, dass das Ergebnis möglicherweise weniger genau ist, weil ein schwaches Signal empfindlicher auf Messrauschen reagiert.
• Ein berechnetes Volumen von 1000 μL oder mehr löst die Warnung aus, eine stärker konzentrierte Probe zu verwenden.
• Ein berechnetes Volumen unter 0,5 μL löst die Warnung aus, dass sich dieses Volumen möglicherweise nicht genau pipettieren lässt.
• Negative Absorptionswerte oder eine negative Probenmasse werden unmittelbar zurückgewiesen.

Praktische Anwendungen im Labor

Eine gleichmäßige Proteinbeladung ist eine der häufigsten Fehlerquellen beim Western Blot: Eine unterschiedliche Bandenintensität zwischen den Spuren spiegelt oft eine ungleiche Proteinbeladung wider und keine tatsächlichen Unterschiede in der Expression. Die Berechnung eines genauen Volumens für jede Probe auf Grundlage ihres eigenen Absorptionsmesswerts sorgt für eine gleichmäßige Beladung des Gels.

Dieselbe Berechnung gilt für Enzymassays, bei denen ein Vergleich der Aktivität unter verschiedenen Bedingungen voraussetzt, dass mit gleichen Gesamtproteinmengen begonnen wird, sowie für die Immunpräzipitation, bei der unterschiedliche eingesetzte Proteinmengen, beispielsweise 800 μg in einem Gefäß gegenüber 1200 μg in einem anderen, den Ergebnisvergleich erschweren. Bei der Proteinaufreinigung wird dieselbe Formel in jedem Schritt verwendet, um zu verfolgen, wie viel Protein in jede Fraktion übergeht.

Vergleich mit anderen Proteintests

Zu den weiteren Methoden zählen die Lowry-Methode, ein älterer kupferbasierter Test, und die direkte UV-Absorbanz bei 280 nm, die keine Reagenzien braucht, aber eine reine Probe ohne Nukleinsäuren voraussetzt.

Eine kurze Geschichte der Proteinquantifizierung

Der BCA-Test baut auf der Biuret-Reaktion auf, bei der Protein in alkalischer Lösung Kupferionen reduziert. Marion Bradford veröffentlichte 1976 eine schnellere Methode mit Farbstoffbindung, die jedoch von den meisten Detergenzien gestört wird. Paul Smith und Kollegen beschrieben die BCA-Methode 1985. Sie verbindet die Biuret-Reaktion mit Bicinchoninsäure, die das reduzierte Kupfer mit hoher Empfindlichkeit nachweist und die in üblichen Zelllysaten enthaltenen Detergenzien verträgt.

Codebeispiel

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Häufig gestellte Fragen

Wofür wird der BCA-Test verwendet? Er misst die Gesamtproteinkonzentration in einer Lösung, meist bevor gleiche Proteinmengen für einen Western Blot aufgetragen werden, bevor Enzymaktivitätstests normalisiert werden oder während die Ausbeute einer Proteinreinigung verfolgt wird.

Wie genau ist der BCA-Test? Die Genauigkeit hängt von einer guten Standardkurve, die zusammen mit den Proben gemessen wird, und davon ab, dass die Probe frei von störenden Substanzen ist. Da verschiedene Proteine unterschiedlich stark Farbe geben, empfiehlt das Kit-Handbuch, bei erforderlicher Genauigkeit ein Standardprotein zu wählen, das dem unbekannten ähnelt.

Was stört die Ergebnisse des BCA-Tests? Reduktionsmittel, darunter DTT und β-Mercaptoethanol, reduzieren Kupfer von selbst, sodass jedes Röhrchen, auch die Blindprobe, dunkelviolett wird. Chelatbildner wie EDTA binden Kupfer und können dazu führen, dass überhaupt keine Farbe entsteht. Dialyse, Entsalzung oder Verdünnung entfernt sie.

Was ist der Unterschied zwischen BCA- und Bradford-Test? Bradford verwendet einen Farbstoff, der Protein bindet und nach etwa 10 Minuten bei 595 nm gemessen wird, doch die meisten Detergenzien stören ihn. Das Standard-BCA-Protokoll dauert 30 Minuten bei 37 °C und verträgt viele Detergenzien, weshalb es eine häufige Wahl für Zelllysate ist.

Warum ist ein berechnetes Probenvolumen ungewöhnlich groß? Ein großes Volumen bedeutet, dass die gemessene Proteinkonzentration niedriger ist als erwartet. Häufige Ursachen sind eine unvollständige Zelllyse, eine zu stark verdünnte Probe oder ein Absorbanzwert nahe der unteren Nachweisgrenze des Tests. Meist hilft es, die Probe mit einem Zentrifugalfilter zu konzentrieren oder auf das Enhanced- oder Micro-BCA-Protokoll zu wechseln.

Was ist zu tun, wenn die Absorbanz außerhalb des linearen Bereichs liegt? Verdünnen Sie die Probe und messen Sie erneut. Eine Standardkurve beschreibt nur den Bereich, den ihre Standards abdecken, daher lässt sich ein Messwert oberhalb des höchsten Standards nicht zuverlässig umrechnen.

Referenzen

1. Thermo Fisher Scientific. Pierce BCA Protein Assay Kit User Guide (MAN0011430). Handbuch zum Pierce-BCA-Kit — Kupferreduktion und Farbe bei 562 nm, Standardbereich von 20–2000 μg/mL und erweiterter Bereich von 5–250 μg/mL, 30 Minuten bei 37 °C, Smith et al. (1985) als Methodenreferenz.
2. Thermo Fisher Scientific. Micro BCA Protein Assay Kit Instructions (MAN0011237). Handbuch zum Micro-BCA-Kit — Bereich von 0,5–20 μg/mL, SDS und Triton X-100 verträglich bis 5 %, Wirkung von Reduktionsmitteln und Chelatbildnern.
3. Thermo Fisher Scientific. Bradford Plus Protein Assay Kit User Guide (MAN0011203). Handbuch zum Bradford-Plus-Kit — Messung bei 595 nm, 10 Minuten Inkubation, Arbeitsbereiche, Störung durch Detergenzien, Bradford (1976) als Methodenreferenz.