BCA Probenvolumen-Rechner | Protein-Quantifizierungstool

Was ist ein BCA-Probenvolumenrechner

Ein BCA-Probenvolumenrechner wandelt einen Absorptionsmesswert aus einem BCA-Proteinassay in das Probenvolumen in Mikrolitern (μL) um, das benötigt wird, um eine festgelegte Proteinmenge aufzutragen. Er wird nach der Durchführung eines Bicinchoninsäure-(BCA-)Proteinassays verwendet, eines gängigen Labortests, der anhand der Menge des violetten, lichtabsorbierenden Farbstoffs bestimmt, wie viel Protein in einer Lösung enthalten ist.

Wie der BCA-Assay Protein misst

Der BCA-Assay funktioniert in zwei Schritten. Zunächst reduziert das Protein in der Probe Kupferionen (Cu²⁺) in einer alkalischen Lösung zu einer anderen Form (Cu¹⁺). Das Ausmaß der Reduktion hängt von der vorhandenen Proteinmenge ab. Anschließend bindet Bicinchoninsäure das reduzierte Kupfer und bildet eine violette Verbindung, die Licht bei einer Wellenlänge von 562 Nanometern (nm) stark absorbiert.

Ein Spektrophotometer misst, wie viel Licht die Probe bei 562 nm absorbiert. Dieser Wert wird als Absorption bezeichnet. Eine dunklere violette Färbung bedeutet eine höhere Absorption und mehr Protein. Im Labor wird die Absorption jeder Probe mit einer Standardkurve verglichen, die durch die Messung bekannter Konzentrationen eines Referenzproteins, meist Rinderserumalbumin (BSA), erstellt wird.

BCA ist beliebt, weil der Assay auch funktioniert, wenn eine Probe Detergenzien wie SDS oder Triton X-100 enthält. Diese Chemikalien kommen häufig in Zelllysepuffern vor, beeinträchtigen jedoch die beiden älteren Assays nach Bradford und Lowry.

Formel zur Umrechnung von BCA-Absorption in Probenvolumen

Eine BCA-Standardkurve ist eine als Gerade angepasste Beziehung zwischen Absorption und Konzentration:

$\text{Absorption} = \text{Steigung} \times \text{Konzentration} + \text{Achsenabschnitt}$

Für die umgekehrte Berechnung, also von einer gemessenen Absorption zurück zur Proteinkonzentration, wird die Gleichung umgestellt:

$\text{Proteinkonzentration (μg/μL)} = \frac{\text{Absorption} - \text{Achsenabschnitt}}{\text{Steigung}}$

Sobald die Konzentration bekannt ist, ergibt sich das Probenvolumen, das eine bestimmte Proteinmasse enthält, aus:

$\text{Probenvolumen (μL)} = \frac{\text{Probenmasse (μg)}}{\text{Proteinkonzentration (μg/μL)}}$

Der Rechner bietet vier voreingestellte Kurventypen mit jeweils eigener Steigung und eigenem Achsenabschnitt. Der Achsenabschnitt beträgt bei jeder Voreinstellung 0, weil die Messwerte um den Leerwert korrigiert werden (zuerst wird die Absorption einer proteinfreien Kontrolle abgezogen). Die Steigung zeigt, welchen Anteil des Absorptionsbereichs der Platte der Arbeitsbereich des jeweiligen Protokolls abdeckt.

Ein empfindlicheres Protokoll für verdünnte Proben erzeugt pro Mikrogramm Protein eine höhere Absorption und hat daher eine größere Steigung. Enhanced-BCA und Micro-BCA sind für Proben vorgesehen, die für eine genaue Messung mit dem Standardprotokoll zu verdünnt sind.

Berechnung des Probenvolumens aus der BCA-Absorption

1. Den BCA-Assay durchführen und für jede Probe die Absorption bei 562 nm messen.
2. Den Kurventyp auswählen, der dem verwendeten Protokoll entspricht (Standard, Enhanced oder Micro), oder eine benutzerdefinierte Steigung und einen Achsenabschnitt aus einer an diesem Tag erstellten Kurve eingeben.
3. Für jede Probe den Absorptionsmesswert und die Zielproteinmasse in Mikrogramm eingeben.
4. Der Rechner wandelt die Absorption in eine Proteinkonzentration um und teilt anschließend die Zielmasse durch diese Konzentration, um das zu pipettierende Volumen zu bestimmen.

Beispiel: Berechnung des Probenvolumens aus der BCA-Absorption

Eine Forschende, die einen Western Blot vorbereitet, benötigt 20 μg Protein pro Spur und verwendet die Standard-BCA-Kurve (Steigung 1,0, Achsenabschnitt 0).

Probe A weist eine Absorption von 0,75 auf:

• Proteinkonzentration = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Probenvolumen = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Probe B weist eine Absorption von 1,2 auf:

• Proteinkonzentration = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Probenvolumen = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Probe A ist stärker verdünnt, daher ist ein größeres Volumen erforderlich, um dieselbe Zielmenge von 20 μg zu erreichen.

Ergebnisse des Rechners verstehen

Der Rechner gibt für jede Probe zwei Werte aus: die Proteinkonzentration in μg/μL und das Probenvolumen in μL. Außerdem kennzeichnet er Ergebnisse, die wahrscheinlich Probleme verursachen:

• Eine Absorption über 3,0 löst eine Warnung aus, da typische BCA-Messwerte zwischen 0 und 2,0 liegen.
• Eine Absorption unter 0,05, aber über null, löst eine Warnung aus, dass das Ergebnis möglicherweise weniger genau ist, weil ein schwaches Signal empfindlicher auf Messrauschen reagiert.
• Ein berechnetes Volumen von 1000 μL oder mehr löst die Warnung aus, eine stärker konzentrierte Probe zu verwenden.
• Ein berechnetes Volumen unter 0,5 μL löst die Warnung aus, dass sich dieses Volumen möglicherweise nicht genau pipettieren lässt.
• Negative Absorptionswerte oder eine negative Probenmasse werden unmittelbar zurückgewiesen.

Praktische Anwendungen im Labor

Eine gleichmäßige Proteinbeladung ist eine der häufigsten Fehlerquellen beim Western Blot: Eine unterschiedliche Bandenintensität zwischen den Spuren spiegelt oft eine ungleiche Proteinbeladung wider und keine tatsächlichen Unterschiede in der Expression. Die Berechnung eines genauen Volumens für jede Probe auf Grundlage ihres eigenen Absorptionsmesswerts sorgt für eine gleichmäßige Beladung des Gels.

Dieselbe Berechnung gilt für Enzymassays, bei denen ein Vergleich der Aktivität unter verschiedenen Bedingungen voraussetzt, dass mit gleichen Gesamtproteinmengen begonnen wird, sowie für die Immunpräzipitation, bei der unterschiedliche eingesetzte Proteinmengen, beispielsweise 800 μg in einem Gefäß gegenüber 1200 μg in einem anderen, den Ergebnisvergleich erschweren. Bei der Proteinaufreinigung wird dieselbe Formel in jedem Schritt verwendet, um zu verfolgen, wie viel Protein in jede Fraktion übergeht.

Vergleich mit anderen Proteinassays

Eine kurze Geschichte der Proteinquantifizierung

Frühe Proteinmessungen beruhten auf der Kjeldahl-Methode (1883), bei der der Stickstoffgehalt nach dem Aufschluss einer Probe in Säure gemessen wurde. Der in den frühen 1900er-Jahren entwickelte Biuret-Test nutzte eine Farbreaktion zwischen Peptidbindungen und Kupferionen, war jedoch nicht besonders empfindlich. Oliver Lowry kombinierte die Biuret-Reaktion im Jahr 1951 mit einem zusätzlichen Reagenz und entwickelte damit die Lowry-Methode, die die Proteinmessung jahrzehntelang dominierte, obwohl sie durch gängige Laborchemikalien wie Detergenzien und EDTA beeinträchtigt wurde. Marion Bradford führte 1976 eine schnellere, auf Farbstoffbindung beruhende Methode ein, die jedoch ebenfalls bei Vorhandensein von Detergenzien versagte und je nach Aminosäuregehalt eines Proteins unterschiedliche Ergebnisse lieferte. Paul Smith und Kollegen bei der Pierce Chemical Company veröffentlichten 1985 die BCA-Methode, bei der die Biuret-Chemie mit der höheren Empfindlichkeit der Bicinchoninsäure gegenüber Kupfer kombiniert wird. Dadurch entstand ein Assay, der die in typischen Zelllysaten vorkommenden Detergenzien toleriert.

Codebeispiel

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Häufig gestellte Fragen

Wofür wird der BCA-Assay verwendet? Er misst die Gesamtproteinkonzentration in einer Lösung, meist bevor gleiche Proteinmengen für einen Western Blot aufgetragen werden, bevor Enzymaktivitätsassays normalisiert werden oder während der Ausbeuteverfolgung bei der Proteinaufreinigung.

Wie genau ist der BCA-Assay? Unter guten Bedingungen weisen die Ergebnisse üblicherweise eine Genauigkeit von 5–10% auf, vorausgesetzt, die Standardkurve umfasst mindestens fünf oder sechs Punkte und die Probe enthält keine hohe Konzentration einer störenden Substanz.

Was beeinflusst die Ergebnisse des BCA-Assays? Reduktionsmittel, darunter DTT und β-Mercaptoethanol, erhöhen die Absorption künstlich, weil sie unabhängig vom Protein selbst Kupfer reduzieren. Chelatbildner wie EDTA verringern die Absorption, indem sie Kupfer binden, bevor es reagieren kann.

Was ist der Unterschied zwischen BCA- und Bradford-Assays? Der Bradford-Assay liefert in etwa fünf Minuten ein Ergebnis, ist jedoch gegenüber Detergenzien störanfällig und reagiert je nach Aminosäurezusammensetzung eines Proteins unterschiedlich. Der BCA-Assay benötigt etwa 30 Minuten, toleriert jedoch Detergenzien und liefert über verschiedene Proteine hinweg konsistentere Messwerte, weshalb er für Zelllysate besser geeignet ist.

Warum ist ein berechnetes Probenvolumen ungewöhnlich groß? Ein großes Volumen bedeutet, dass die gemessene Proteinkonzentration niedriger als erwartet ist. Häufige Ursachen sind eine unvollständige Zelllyse, eine zu stark verdünnte Probe oder ein Absorptionsmesswert nahe der unteren Nachweisgrenze des Assays. Eine Aufkonzentrierung der Probe mit einem Zentrifugalfilter oder der Wechsel zum Enhanced- oder Micro-BCA-Protokoll behebt das Problem meist.

Was ist zu tun, wenn die Absorption außerhalb des linearen Bereichs liegt? Die Probe verdünnen und erneut messen. Oberhalb von ungefähr 2,0 bricht der Zusammenhang zwischen Absorption und Konzentration zusammen, sodass eine Extrapolation über die Standardkurve hinaus die tatsächliche Konzentration unterschätzt.

Referenzen

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT et al. „Measurement of protein using bicinchoninic acid.“ Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. „Pierce BCA Protein Assay Kit“, Benutzerhandbuch (MAN0011430).
3. Bradford MM. „A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.“ Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.