Υπολογιστής Θερμοκρασίας Υβριδισμού DNA | Δωρεάν Εργαλείο Tm PCR

Τι είναι ένας υπολογιστής θερμοκρασίας υβριδοποίησης DNA;

Ένας υπολογιστής θερμοκρασίας υβριδοποίησης DNA εκτιμά τη θερμοκρασία τήξης (Tm) ενός εκκινητή DNA από την αλληλουχία του. Η Tm είναι η θερμοκρασία στην οποία τα μισά μόρια του εκκινητή είναι συνδεδεμένα με τη συμπληρωματική τους αλυσίδα-στόχο και τα άλλα μισά όχι. Σε μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), η τιμή αυτή καθοδηγεί την επιλογή της θερμοκρασίας στην οποία οι εκκινητές προσδένονται στο πρότυπο DNA.

Γιατί έχει σημασία η θερμοκρασία υβριδοποίησης στην PCR

Η PCR αντιγράφει ένα τμήμα-στόχο του DNA μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων θέρμανσης και ψύξης. Κάθε κύκλος έχει τρία βήματα. Πρώτα, η θέρμανση διαχωρίζει το δίκλωνο πρότυπο περίπου στους 95 °C. Το βήμα αυτό ονομάζεται αποδιάταξη. Έπειτα, η αντίδραση ψύχεται στη θερμοκρασία υβριδοποίησης, συνήθως μεταξύ 50 °C και 65 °C, ώστε οι μικροί εκκινητές να μπορούν να προσδεθούν σε συμπληρωματικές αλληλουχίες των μονόκλωνων αλυσίδων. Τέλος, η θερμοκρασία αυξάνεται περίπου στους 72 °C και ένα ένζυμο που ονομάζεται DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές, σχηματίζοντας νέες αλυσίδες DNA.

Αν η θερμοκρασία υβριδοποίησης είναι πολύ χαμηλή, οι εκκινητές προσδένονται σε αλληλουχίες που ταιριάζουν μόνο εν μέρει, με αποτέλεσμα να παράγονται επιπλέον ανεπιθύμητα τμήματα DNA. Αν είναι πολύ υψηλή, οι εκκινητές δεν μπορούν να σχηματίσουν σταθερό δεσμό με το πρότυπο και αντιγράφεται ελάχιστο ή καθόλου DNA. Η θερμοκρασία υβριδοποίησης είναι μία από τις πρώτες ρυθμίσεις που προσαρμόζουν οι ερευνητές όταν αποτυγχάνει μια αντίδραση PCR.

Πώς επηρεάζει η περιεκτικότητα σε GC την Tm

Ένας εκκινητής ζευγαρώνει με την αλληλουχία-στόχο του μέσω δεσμών υδρογόνου. Ένα ζεύγος γουανίνης-κυτοσίνης (G-C) σχηματίζει τρεις δεσμούς υδρογόνου. Ένα ζεύγος αδενίνης-θυμίνης (A-T) σχηματίζει δύο. Ένας εκκινητής με περισσότερες βάσεις G και C χρειάζεται περισσότερη θερμότητα για να διαχωριστεί, επομένως έχει υψηλότερη Tm από έναν εκκινητή ίδιου μήκους με περισσότερες βάσεις A και T. Η περιεκτικότητα σε GC γράφεται συνήθως ως ποσοστό: ο αριθμός των βάσεων G και C διαιρούμενος με το συνολικό μήκος της αλληλουχίας, επί 100.

Τύπος θερμοκρασίας υβριδοποίησης DNA

Αυτός ο υπολογιστής εφαρμόζει έναν από δύο τύπους, ανάλογα με το μήκος του εκκινητή.

Για εκκινητές 14 νουκλεοτιδίων ή μεγαλύτερους, χρησιμοποιεί τον τύπο Marmur-Doty για την περιεκτικότητα σε GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Εδώ, το N_GC είναι ο αριθμός των βάσεων G και C στον εκκινητή, μετρώντας τις απευθείας και όχι ως ποσοστό. Το N είναι ο συνολικός αριθμός βάσεων.

Για εκκινητές μικρότερους από 14 νουκλεοτίδια, χρησιμοποιεί τον κανόνα Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

Τα A, T, G και C αντιπροσωπεύουν το πλήθος της αντίστοιχης βάσης στον εκκινητή.

Και οι δύο τύποι θεωρούν συνήθεις συνθήκες PCR: περίπου 50 νανομοριακός εκκινητής και 50 χιλιοστομοριακό Na+.

Λυμένο παράδειγμα

Έστω ο εκκινητής 19 βάσεων ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Το μήκος του είναι 19, δηλαδή 14 ή περισσότερο, επομένως ο υπολογιστής χρησιμοποιεί τον τύπο Marmur-Doty.

• Μήκος (N) = 19
• Πλήθος G = 5, πλήθος C = 5, επομένως N_GC = 10 και η περιεκτικότητα σε GC είναι 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Ο τύπος χρησιμοποιεί το πλήθος GC, 10, και όχι το ποσοστό GC, 52,6. Η λανθασμένη χρήση του ποσοστού δίνει Tm περίπου 143 °C, τιμή που δεν είναι ρεαλιστική για αντίδραση PCR που εκτελείται μεταξύ 50 °C και 95 °C.

Τρόπος χρήσης αυτού του υπολογιστή

Πληκτρολογήστε ή επικολλήστε μια αλληλουχία εκκινητή χρησιμοποιώντας μόνο τα γράμματα A, T, G και C. Ο υπολογιστής εμφανίζει το μήκος της αλληλουχίας σε νουκλεοτίδια (nt), την περιεκτικότητα σε GC ως ποσοστό και την υπολογισμένη θερμοκρασία υβριδοποίησης σε βαθμούς Κελσίου. Το αποτέλεσμα μπορεί να αντιγραφεί σε εργαστηριακές σημειώσεις ή σε ένα πρωτόκολλο.

Επιλογή θερμοκρασίας υβριδοποίησης PCR

Η Tm είναι υπολογισμένη εκτίμηση και όχι εγγυημένη θερμοκρασία λειτουργίας. Πολλά πρωτόκολλα PCR ξεκινούν το πραγματικό στάδιο υβριδοποίησης λίγους βαθμούς κάτω από την υπολογισμένη Tm και στη συνέχεια προσαρμόζουν τη θερμοκρασία με βάση το αποτέλεσμα σε πήκτωμα. Για ένα ζεύγος εκκινητών, ως αρχικό σημείο χρησιμοποιείται συνήθως η χαμηλότερη από τις δύο τιμές Tm. Η PCR βαθμίδας, η οποία εκτελεί ταυτόχρονα αρκετές αντιδράσεις σε ένα εύρος θερμοκρασιών, είναι συνηθισμένος τρόπος εύρεσης της καλύτερης θερμοκρασίας μέσω δοκιμών.

Άλλοι τρόποι εκτίμησης της Tm

Οι τύποι Marmur-Doty και Wallace που χρησιμοποιούνται εδώ είναι γρήγορες προσεγγίσεις, βασισμένες μόνο στη σύσταση των βάσεων. Υπάρχουν και άλλες μέθοδοι:

• Η θερμοδυναμική των γειτονικών βάσεων λαμβάνει υπόψη τον τρόπο με τον οποίο κάθε ζεύγος διαδοχικών βάσεων επηρεάζει τη σταθερότητα και θεωρείται η ακριβέστερη μέθοδος για τυπικούς εκκινητές.
• Οι τύποι με διόρθωση για τα άλατα προσθέτουν διόρθωση για τη συγκέντρωση ιόντων Na+ ή K+ στο ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης, επειδή υψηλότερη συγκέντρωση άλατος σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA και αυξάνει την Tm.

Διαφορετικοί υπολογιστές μπορούν να δώσουν διαφορετικές τιμές Tm για τον ίδιο εκκινητή, επειδή χρησιμοποιούν διαφορετικούς τύπους. Η εκτέλεση της PCR και ο έλεγχος του αποτελέσματος παραμένουν η τελική δοκιμή.

Συχνές ερωτήσεις

Τι είναι η θερμοκρασία υβριδοποίησης του DNA;

Είναι η θερμοκρασία στην οποία οι εκκινητές DNA προσδένονται στη συμπληρωματική τους αλληλουχία πάνω σε μια αλυσίδα-πρότυπο κατά την PCR. Τα εργαστήρια συνήθως ρυθμίζουν τη θερμοκρασία λίγους βαθμούς κάτω από την υπολογισμένη θερμοκρασία τήξης (Tm) του εκκινητή.

Πώς υπολογίζεται η Tm του εκκινητή;

Για εκκινητές 14 βάσεων ή μεγαλύτερους, Tm = 64,9 + 41 × (πλήθος GC − 16,4) / μήκος. Για εκκινητές μικρότερους από 14 βάσεις, Tm = 2 × (πλήθος A+T) + 4 × (πλήθος G+C).

Γιατί η περιεκτικότητα σε GC αυξάνει την Tm;

Τα ζεύγη βάσεων G-C σχηματίζουν τρεις δεσμούς υδρογόνου, σε σύγκριση με δύο για τα ζεύγη A-T. Ένας εκκινητής με μεγαλύτερο ποσοστό βάσεων G και C χρειάζεται περισσότερη ενέργεια και, επομένως, υψηλότερη θερμοκρασία για να διαχωριστεί από την αλληλουχία-στόχο του.

Πρέπει η θερμοκρασία υβριδοποίησης PCR να είναι ίση με την υπολογισμένη Tm;

Όχι. Τα περισσότερα πρωτόκολλα ξεκινούν αρκετούς βαθμούς κάτω από την υπολογισμένη Tm και προσαρμόζουν τη θερμοκρασία από εκεί, επειδή η Tm σηματοδοτεί το σημείο στο οποίο είναι συνδεδεμένο μόνο το ήμισυ του εκκινητή.

Επηρεάζει το μήκος του εκκινητή την Tm;

Ναι, αν και όχι με απλό τρόπο. Το μήκος βρίσκεται στον παρονομαστή του τύπου Marmur-Doty, επομένως ένας μακρύτερος εκκινητής με μέση περιεκτικότητα σε GC δεν έχει αυτόματα υψηλότερη Tm από έναν μικρότερο, πλούσιο σε GC εκκινητή.

Γιατί διαφωνούν οι διαφορετικοί υπολογιστές Tm;

Χρησιμοποιούν διαφορετικούς τύπους. Ο κανόνας Wallace, ο τύπος Marmur-Doty για την περιεκτικότητα σε GC, η θερμοδυναμική των γειτονικών βάσεων και οι τύποι με διόρθωση για τα άλατα μπορούν να δώσουν διαφορετική Tm για τον ίδιο εκκινητή, μερικές φορές με διαφορά αρκετών βαθμών.

Παραπομπές

1. Marmur J, Doty P. Προσδιορισμός της σύστασης βάσεων του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος από τη θερμοκρασία θερμικής αποδιάταξής του. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Υβριδοποίηση συνθετικών ολιγοδεοξυριβονουκλεοτιδίων με DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Ενοποιημένη θεώρηση της θερμοδυναμικής γειτονικών βάσεων σε πολυμερή, DNA τύπου dumbbell και ολιγονουκλεοτίδια. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.