Υπολογιστής Αριθμού Αντιγράφων DNA | Εργαλείο Γονιδιωματικής Ανάλυσης

Υπολογιστής αριθμού αντιγράφων DNA

Ένας υπολογιστής αριθμού αντιγράφων DNA εκτιμά πόσα αντίγραφα μιας αλληλουχίας-στόχου υπάρχουν σε ένα δείγμα DNA. Χρησιμοποιεί τη συγκέντρωση και τον όγκο του δείγματος, καθώς και τη συχνότητα εμφάνισης της αλληλουχίας-στόχου μέσα στη μεγαλύτερη αλληλουχία DNA. Τα εργαστήρια μοριακής βιολογίας χρησιμοποιούν αυτή την εκτίμηση για να σχεδιάσουν πειράματα όπως η qPCR (ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) πριν πραγματοποιήσουν μια ακριβότερη και ακριβέστερη δοκιμασία.

Τι σημαίνει ο αριθμός αντιγράφων DNA

Ο αριθμός αντιγράφων DNA είναι ο αριθμός των φορών που εμφανίζεται μια συγκεκριμένη αλληλουχία σε ένα γονιδίωμα ή δείγμα. Ένα τυπικό ανθρώπινο γονίδιο εμφανίζεται δύο φορές, μία φορά κληρονομημένο από κάθε γονέα. Διάφοροι παράγοντες μπορούν να αλλάξουν αυτόν τον αριθμό.

• Ενίσχυση: περισσότερα από δύο αντίγραφα. Τα καρκινικά κύτταρα συχνά ενισχύουν γονίδια που προάγουν την ανάπτυξη, όπως το HER2 σε ορισμένους όγκους του μαστού.
• Διαγραφή: λιγότερα από δύο αντίγραφα, μερικές φορές κανένα. Οι διαγραφές μπορούν να προκαλέσουν γενετικές διαταραχές.
• Διπλασιασμός: εμφανίζεται ένα επιπλέον αντίγραφο εκεί όπου θα έπρεπε να υπάρχει μόνο ένα ή δύο.
• Παραλλαγή αριθμού αντιγράφων (CNV): φυσιολογική διαφορά στον αριθμό αντιγράφων μεταξύ ατόμων, η οποία εντοπίζεται σε σημαντικό τμήμα του ανθρώπινου γονιδιώματος.

Τύπος υπολογισμού του αριθμού αντιγράφων DNA

Ο υπολογιστής μετατρέπει τις εμφανίσεις της αλληλουχίας και τη μάζα του δείγματος σε αριθμό αντιγράφων με τον ακόλουθο τύπο:

$\text{Αριθμός αντιγράφων} = \frac{\text{Εμφανίσεις} \times \text{Συγκέντρωση} \times \text{Όγκος} \times N_A}{\text{Μήκος DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Όπου:

• Εμφανίσεις — πόσες φορές εμφανίζεται η αλληλουχία-στόχος στην πλήρη αλληλουχία DNA, με τις επικαλυπτόμενες αντιστοιχίσεις να υπολογίζονται ξεχωριστά.
• Συγκέντρωση — η συγκέντρωση του DNA σε νανογραμμάρια ανά μικρολίτρο (ng/μL), η οποία συνήθως μετράται με φασματοφωτόμετρο ή φθοριόμετρο.
• Όγκος — ο όγκος του δείγματος σε μικρολίτρα (μL).
• $N_A$ — ο αριθμός του Avogadro, 6,022 × 10²³ μόρια ανά mol. Μετατρέπει τα mol DNA σε αριθμό μορίων.
• Μήκος DNA — το μήκος της πλήρους αλληλουχίας DNA, σε ζεύγη βάσεων.
• 660 — το μέσο μοριακό βάρος ενός ζεύγους βάσεων DNA, σε γραμμάρια ανά mol (g/mol). Ένα ζεύγος βάσεων αποτελείται από δύο ζευγαρωμένα νουκλεοτίδια, ένα από κάθε κλώνο DNA.
• 10⁹ — μετατρέπει τα νανογραμμάρια σε γραμμάρια.

Ο τύπος μετατρέπει πρώτα τη μάζα του δείγματος σε mol μορίων DNA, την πολλαπλασιάζει με τον αριθμό του Avogadro για να βρει τον συνολικό αριθμό μορίων DNA στο δείγμα και, στη συνέχεια, πολλαπλασιάζει με τον αριθμό των φορών που εμφανίζεται η αλληλουχία-στόχος σε κάθε μόριο.

Το εργαλείο δέχεται μόνο τα γράμματα A, T, C και G. Τα κενά και οι αλλαγές γραμμής αγνοούνται, ενώ τα πεζά γράμματα θεωρούνται ίδια με τα κεφαλαία.

Πώς υπολογίζεται ο αριθμός αντιγράφων DNA: παράδειγμα με υπολογισμό

Έστω μια αλληλουχία DNA 12 ζευγών βάσεων, ATCGATCGATCG, με αλληλουχία-στόχο ATCG, συγκέντρωση 10 ng/μL και όγκο 20 μL.

Βήμα 1: Μέτρηση των εμφανίσεων. Η ATCG εμφανίζεται 3 φορές στην ATCGATCGATCG, στις θέσεις 1, 5 και 9.

Βήμα 2: Εύρεση της συνολικής μάζας DNA. Συγκέντρωση × όγκος = 10 × 20 = 200 ng.

Βήμα 3: Μετατροπή σε mol. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Διαίρεση με (12 ζεύγη βάσεων × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Αυτό δίνει 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Βήμα 4: Μετατροπή σε αριθμό μορίων. Πολλαπλασιασμός με τον αριθμό του Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ μόρια/mol ≈ 1,52 × 10¹³ μόρια DNA.

Βήμα 5: Πολλαπλασιασμός με τις εμφανίσεις. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, δηλαδή περίπου 45.621.212.121.212 αντίγραφα.

Ο αριθμός αυτός φαίνεται τεράστιος, επειδή ένα δείγμα 20 μL με 10 ng/μL εξακολουθεί να περιέχει τρισεκατομμύρια μικρά μόρια DNA. Τα πραγματικά δείγματα συνήθως περιέχουν πολύ μεγαλύτερες αλληλουχίες, γεγονός που μειώνει τον αριθμό μορίων για την ίδια μάζα.

Πού χρησιμοποιείται η ανάλυση του αριθμού αντιγράφων DNA

Διάγνωση καρκίνου. Τα εργαστήρια παθολογοανατομίας ελέγχουν τον αριθμό αντιγράφων του HER2 σε ιστό όγκου του μαστού. Ένα φυσιολογικό κύτταρο φέρει δύο αντίγραφα. Ένας ενισχυμένος όγκος μπορεί να φέρει έξι ή περισσότερα, γεγονός που επηρεάζει την καταλληλότητα για στοχευμένα φάρμακα όπως η τραστουζουμάμπη.

Έλεγχος γενετικών ασθενειών. Καταστάσεις όπως το σύνδρομο DiGeorge περιλαμβάνουν διαγραφή τμήματος χρωμοσώματος. Το σύνδρομο Down περιλαμβάνει ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 21 (τρισωμία 21). Η καταμέτρηση των αντιγράφων βοηθά στην επιβεβαίωση αυτών των διαγνώσεων.

Ποσοτικοποίηση διαγονιδίων και πλασμιδίων. Οι ερευνητές ελέγχουν πόσα αντίγραφα ενός εισαγόμενου γονιδίου ενσωματώθηκαν σε φυτικό, ζωικό ή βακτηριακό κύτταρο. Συνήθως προτιμάται ένα μόνο αντίγραφο, επειδή τα πολλαπλά αντίγραφα μπορούν να προκαλέσουν στο κύτταρο σίγαση του γονιδίου.

Παρακολούθηση παθογόνων και ιικού φορτίου. Οι εκτιμήσεις του αριθμού αντιγράφων παρακολουθούν την ποσότητα ιικού ή βακτηριακού DNA που υπάρχει σε ένα δείγμα· η μέθοδος χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση λοιμώξεων και για περιβαλλοντικούς ελέγχους.

Άλλες μέθοδοι μέτρησης του αριθμού αντιγράφων

Αυτός ο υπολογιστής παρέχει μια γρήγορη εκτίμηση από δεδομένα αλληλουχίας και συγκέντρωσης. Τα εργαστήρια που χρειάζονται μεγαλύτερη ακρίβεια χρησιμοποιούν συνήθως μία από τις ακόλουθες μεθόδους:

• Ποσοτική PCR (qPCR): ενισχύει και μετρά το DNA σε πραγματικό χρόνο· η ακρίβεια είναι περίπου 15–20% με καλή πρότυπη καμπύλη.
• Ψηφιακή PCR (dPCR): διαχωρίζει ένα δείγμα σε χιλιάδες μικροσκοπικές αντιδράσεις για άμεση καταμέτρηση, χωρίς να απαιτείται πρότυπη καμπύλη.
• Υβριδοποίηση in situ με φθορισμό (FISH): μετρά οπτικά τις αλληλουχίες απευθείας σε κύτταρα ή χρωμοσώματα με τη χρήση μικροσκοπίου· αποτελεί την τυπική μέθοδο σε πολλά εργαστήρια διάγνωσης καρκίνου.
• Αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS): αλληλουχεί ολόκληρο το δείγμα και καταγράφει ταυτόχρονα τον αριθμό αντιγράφων σε όλο το γονιδίωμα.

Συχνές ερωτήσεις

Τι είναι ο αριθμός αντιγράφων DNA; Είναι ο αριθμός των φορών που εμφανίζεται μια δεδομένη αλληλουχία DNA σε ένα γονιδίωμα ή δείγμα. Τα περισσότερα ανθρώπινα γονίδια εμφανίζονται δύο φορές, μία φορά από κάθε γονέα. Τα επιπλέον ή ελλείποντα αντίγραφα μπορούν να επηρεάσουν την υγεία και τον κίνδυνο ασθένειας.

Πόσο ακριβής είναι αυτός ο υπολογιστής; Παρέχει μια θεωρητική εκτίμηση που βασίζεται στις παρεχόμενες εισόδους και όχι σε εργαστηριακή μέτρηση. Η ακρίβεια εξαρτάται από το πόσο ακριβώς μετρήθηκε η συγκέντρωση και από το πόσο ειδική είναι η αλληλουχία-στόχος. Μέθοδοι όπως η ψηφιακή PCR είναι ακριβέστερες για αποτελέσματα που δημοσιεύονται.

Μπορεί αυτός ο υπολογιστής να χρησιμοποιηθεί για RNA; Όχι. Το RNA χρησιμοποιεί ουρακίλη αντί για θυμίνη και διαφορετικό σάκχαρο, επομένως το μοριακό του βάρος διαφέρει από εκείνο του DNA. Το RNA έχει μέσο μοριακό βάρος περίπου 330 g/mol ανά νουκλεοτίδιο, σε σύγκριση με περίπου 660 g/mol ανά ζεύγος βάσεων DNA. Η χρήση του τύπου DNA σε δεδομένα RNA θα έδινε λανθασμένο αποτέλεσμα.

Γιατί μια επικαλυπτόμενη αλληλουχία μετράται περισσότερες από μία φορές; Ο υπολογιστής μετρά κάθε θέση όπου ταιριάζει η αλληλουχία-στόχος, ακόμη και όταν οι αντιστοιχίσεις μοιράζονται γράμματα. Στην ATATAT, η αλληλουχία ATA ταιριάζει δύο φορές, στη θέση 1 και στη θέση 3, επειδή κάθε αρχική θέση ελέγχεται ανεξάρτητα.

Ποιο εύρος συγκέντρωσης DNA λειτουργεί καλύτερα; Συγκεντρώσεις 10–100 ng/μL παρέχουν τις πιο αξιόπιστες μετρήσεις σε τυπικά εργαστηριακά όργανα. Κάτω από 10 ng/μL, το σφάλμα μέτρησης αυξάνεται και συνιστάται μια πιο ευαίσθητη μέθοδος, όπως το φθοριόμετρο, αντί για ένα τυπικό φασματοφωτόμετρο.

Μπορεί αυτός ο υπολογιστής να εκτιμήσει τον αριθμό αντιγράφων πλασμιδίου; Ναι. Εισαγάγετε την πλήρη αλληλουχία του πλασμιδίου ως αλληλουχία DNA και μια μοναδική περιοχή του ενθέματος ως αλληλουχία-στόχο, μαζί με τη μετρημένη συγκέντρωση του πλασμιδίου και τον όγκο του δείγματος.