Calculadora de Eficiencia de qPCR: Herramienta de Análisis de Curva Estándar

Calculadora de eficiencia de qPCR

Una calculadora de eficiencia de qPCR estima hasta qué punto una reacción de PCR cuantitativa (qPCR) copia su secuencia de ADN diana en cada ciclo de amplificación. Utiliza valores Ct (el número de ciclo en el que la señal fluorescente cruza un umbral establecido) de una serie de diluciones para calcular la eficiencia, la pendiente, la ordenada en el origen y R².

¿Qué es la eficiencia de la qPCR?

La PCR cuantitativa registra la fluorescencia a medida que una reacción copia una secuencia de ADN diana, ciclo a ciclo. La eficiencia de amplificación describe cuánto aumenta la cantidad de ADN diana en cada ciclo. Con una eficiencia de 100 %, la cantidad de ADN diana se duplica en cada ciclo.

En la práctica, las reacciones rara vez alcanzan exactamente 100 %. La mayoría de los laboratorios considera aceptable una eficiencia de entre 90 % y 110 % para una cuantificación fiable. Un valor inferior a 90 % o superior a 110 % apunta a un problema, como un diseño deficiente de los cebadores, inhibidores de la PCR arrastrados durante la extracción de la muestra o errores de pipeteo en la serie de diluciones.

La eficiencia es más importante al comparar la expresión génica entre muestras. El método común ΔΔCt para calcular el cambio relativo supone que todas las reacciones funcionan con una eficiencia de 100 %. Cuando la eficiencia medida difiere de 100 %, o cuando un gen diana y un gen de referencia tienen eficiencias diferentes, los resultados del cambio relativo pueden ser inexactos.

Fórmula de la eficiencia de qPCR

La eficiencia se calcula a partir de la pendiente de la curva estándar, una recta que se obtiene al representar los valores de Ct frente al logaritmo en base 10 (log10) de la cantidad de ADN inicial en una serie de diluciones.

E = 10^(-1/pendiente) - 1

E es la eficiencia, expresada como decimal (se multiplica por 100 para obtener el porcentaje). La pendiente es la de la recta de la curva estándar. Es negativa porque el Ct aumenta a medida que disminuye la cantidad de ADN inicial.

Una pendiente de -3,32 corresponde a una eficiencia de 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301 - 1 ≈ 1,00

Esto se debe a que una dilución de 10 veces debería desplazar el Ct aproximadamente 3,32 ciclos si la reacción duplica su ADN en cada ciclo, ya que log2(10) es aproximadamente 3,32.

En la práctica, se considera aceptable una pendiente de entre -3,1 y -3,6. Ese intervalo corresponde a una eficiencia de aproximadamente 90 % a 110 %. Una pendiente más cercana a -3,1 produce una eficiencia calculada más alta; una pendiente más cercana a -3,6 produce una más baja.

Cómo calcular la eficiencia de qPCR: el método de la curva estándar

Prepare una serie de diluciones. Comience con la muestra más concentrada y dilúyala mediante un factor fijo, normalmente 10 veces, para cada muestra posterior. Realice la qPCR con cada dilución y registre su valor Ct.
Convierta cada dilución a un valor log10. Si se cuenta la primera muestra, la más concentrada, como posición 0, la muestra número i tiene un log10 de la cantidad relativa igual a -i × log10(factor de dilución).
Represente Ct (eje vertical) frente al valor log10 (eje horizontal) para cada dilución y realice una regresión lineal.
Obtenga la pendiente, la ordenada en el origen y R² de la recta de regresión.
Sustituya la pendiente en E = 10^(-1/pendiente) - 1 para obtener la eficiencia.

Criterios de calidad de la curva estándar

R² de al menos 0,98. Este valor mide en qué grado los puntos se ajustan a una línea recta. Un valor inferior suele indicar errores de pipeteo o una amplificación inconsistente.
Pendiente entre -3,1 y -3,6. Este intervalo corresponde a una eficiencia del 90-110%.
Al menos tres puntos de dilución. Cinco o seis puntos proporcionan una recta más fiable y facilitan la detección de valores atípicos.
La muestra más concentrada debería dar un Ct de aproximadamente 15-20. La muestra más diluida debería mantenerse por debajo de Ct 35, ya que los valores superiores se aproximan al límite de detección.

Ejemplo de cálculo

Una serie de diluciones de cinco puntos, de 10 veces, produce estos valores Ct, de la más concentrada a la menos concentrada: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Los valores de log10(cantidad relativa) son 0, -1, -2, -3, -4, ya que cada paso de dilución añade -log10(10), es decir, -1. El Ct aumenta 3,5 ciclos en cada paso, por lo que los puntos forman una línea recta y la regresión lineal produce:

Pendiente: -3,5
Ordenada en el origen: 15,0
R²: 1,0

Eficiencia: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286 - 1 ≈ 0,931, es decir, alrededor del 93 %.

Una eficiencia de 93 % con R² = 1,0 cumple los criterios de calidad estándar y es adecuada para cuantificar la expresión génica.

Ejemplo de código

Esta función de JavaScript sigue el mismo método que la calculadora. El índice de cada valor Ct se niega antes de calcular el logaritmo, porque la primera muestra, la más concentrada, tiene la mayor cantidad relativa y cada muestra posterior está más diluida.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Por qué es importante la eficiencia para la expresión génica

Los cálculos del cambio en número de veces, incluido el método ΔΔCt, suponen que cada reacción duplica su diana en cada ciclo. Cuando el gen diana y el gen de referencia tienen eficiencias medidas distintas, la fórmula simple de ΔΔCt introduce error. Los investigadores suelen pasar a un cálculo con corrección de eficiencia, como el método que describió Michael Pfaffl en 2001, cuando las eficiencias difieren en más de unos cinco puntos porcentuales. Las directrices MIQE, un conjunto de normas de notificación para la qPCR muy citado y publicado en 2009, recomiendan que los estudios informen de la eficiencia calculada, la pendiente y el R² junto con los resultados de cuantificación.

Preguntas frecuentes

¿Qué porcentaje de eficiencia de qPCR es bueno?

En general se acepta un valor entre el 90 % y el 110 %, y los ensayos bien optimizados rondan el 95-105%. Una pendiente de -3,32 corresponde exactamente al 100 %.

¿Por qué mi eficiencia de qPCR supera 110 %?

Entre las causas comunes se encuentran los errores de pipeteo en la serie de diluciones, los dímeros de cebadores, los inhibidores que afectan de manera desigual a las muestras concentradas y diluidas, o un umbral de fluorescencia establecido fuera de la fase exponencial de la amplificación. Una curva de fusión con más de un pico puede indicar la presencia de dímeros de cebadores.

¿Por qué mi eficiencia de qPCR es inferior a 90 %?

Entre las causas probables se encuentran un diseño deficiente de los cebadores, inhibidores de la PCR arrastrados durante la extracción de la muestra o una temperatura de alineamiento subóptima. Comprobar la especificidad de los cebadores y realizar un gradiente de temperatura puede ayudar a encontrar la causa.

¿Qué significa un valor bajo de R²?

El R² mide qué tan bien se ajustan los valores de Ct a una recta frente al logaritmo de la dilución. Un valor inferior a 0,98 sugiere inconsistencias al pipetear, una muestra inhibida o un punto de dilución cercano al límite de detección.

¿Cuántos puntos de dilución necesita una curva estándar?

Al menos tres, el mínimo necesario para una regresión lineal. Cinco o seis puntos proporcionan una pendiente más fiable y facilitan la detección de valores atípicos.

¿Puede cambiar la eficiencia entre experimentos?

Sí. Un nuevo lote de reactivos, un nuevo lote de cebadores, un tipo de muestra diferente o un instrumento de qPCR distinto pueden modificar la eficiencia. Muchos laboratorios vuelven a comprobar la eficiencia cada pocos meses o con cada nuevo lote de reactivos.

Referencias

Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification, 2015. Svec et al. 2015 (PMC) — E = 10^(−1/pendiente) − 1, y una pendiente de aproximadamente −3,3 para una serie con factor de dilución 10 y una eficiencia del 100 %.
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001. Pfaffl 2001 (PMC) — el modelo de cuantificación relativa con corrección de eficiencia; la E = 10^(−1/pendiente) de Pfaffl es el factor de amplificación por ciclo, igual a 1 más la eficiencia usada en este artículo.

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