Rakudilutsioonikalkuaator - Täpne Labori Lahjendamise Tööriist

Rakkude lahjendamise kalkulaator

Rakkude lahjendamise kalkulaator leiab, kui palju rakususpensiooni ja kui palju lahjendit tuleb kokku segada, et saavutada valitud lõppmahuks soovitud rakkude kontsentratsioon. Seda kasutatakse rakukultuuris, mikrobioloogias ja muus laboritöös, kus proov tuleb enne kasutamist viia täpselt kindlaksmääratud kontsentratsioonini.

Mida rakkude lahjendamine tähendab

Rakususpensiooni lahjendamine ei muuda selles sisalduvate rakkude arvu. See muudab ainult ruumala, milles rakud paiknevad, vähendades seega kontsentratsiooni. Suspensioon, mille kontsentratsioon on 1 000 000 rakku milliliitri kohta (rakku/ml), sisaldab pärast lahjendamist endiselt sama arvu rakke. See arv on lihtsalt jaotunud suurema vedelikukoguse peale.

Laborites lahjendatakse rakke enne paljusid tavapäraseid etappe: kasvava kultuuri jaotamist uutesse kolbidesse, kindla arvu rakkude külvamist igasse plaadi süvendisse, rakkude külmutamist säilitamiseks või proovi ettevalmistamist rakuloenduri või voolutsütomeetri jaoks.

Rakkude lahjendamise valem

Arvutus põhineb ühel reeglil. Varususpensioonist võetud rakkude arv, korrutatuna nende kontsentratsiooniga, peab võrduma lõppmahus olevate rakkude arvuga, korrutatuna sihtkontsentratsiooniga:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — algkontsentratsioon (varususpensiooni kontsentratsioon), rakku/ml
• V₁ — kasutatava varususpensiooni ruumala, ml
• C₂ — sihtkontsentratsioon, rakku/ml
• V₂ — vajalik kogu lõppmaht, ml

Avaldise V₁ järgi lahendades saadakse pipeteeritava varususpensiooni ruumala:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Ülejäänud osa lõppmahust moodustab lahjendi, milleks on tavaliselt rakukultuurikeskkond, fosfaatpuhverdatud füsioloogiline lahus (PBS) või muu puhver:

Lahjendi ruumala = V₂ − V₁

Sihtkontsentratsioon (C₂) ei saa kunagi olla suurem kui varususpensiooni kontsentratsioon (C₁). Lahjendamine vähendab kontsentratsiooni. Selle suurendamiseks tuleb rakud tsentrifuugida põhja ja suspendeerida need uuesti väiksemas vedelikukoguses.

Kuidas arvutada rakkude lahjendust

1. Loendage varususpensioon hemotsütomeetri või automaatse rakuloenduri abil, et saada C₁.
2. Märkige üles protokollis nõutud sihtkontsentratsioon C₂.
3. Määrake vajalik kogu lõppmaht V₂.
4. Arvutage V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Arvutage lahjendi ruumala: V₂ − V₁.
6. Pipeteerige V₁ varususpensiooni tuubi, seejärel lisage keskkonna või puhvri lahjendi ruumala.

Näidisarvutus

Varususpensiooni kontsentratsioon on 1 000 000 rakku/ml. Protokoll nõuab lõppmahuks 10 mL kontsentratsiooni 100 000 rakku/ml.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Lahjendi ruumala = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

1 mL varususpensiooni võtmine ja 9 mL keskkonna lisamine annab 10 mL suspensiooni kontsentratsiooniga 100 000 rakku/ml.

Teine näide

96-süvendiga plaadianalüüs vajab igasse süvendisse 10 000 rakku ja 200 mikroliitrit (μL) keskkonda süvendi kohta. See vastab sihtkontsentratsioonile 50 000 rakku/ml, sest 10 000 raku jagamisel mahuga 0,2 mL saadakse 50 000 rakku/ml. Varususpensiooni kontsentratsioon on 2 000 000 rakku/ml ning plaadi katmiseks koos pipeteerimiskadude varuga on vaja kokku 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Lahjendi ruumala = 20 − 0,5 = 19,5 mL

0,5 mL varususpensiooni segamine 19,5 mL keskkonnaga annab 20 mL suspensiooni kontsentratsiooniga 50 000 rakku/ml, mis on 1-osa-40-st lahjendus.

Veaallikad

Valem ise on täpne. Vead tulenevad sellesse sisestatud arvudest.

• Loendamisviga. Vale rakuloendus kandub otse üle valeks lahjenduseks. Hemotsütomeetri võrgustiku kõigi nelja nurgaruudu loendamine ja nende keskmise arvutamine vähendab seda riski.
• Kokku kleepunud rakud. Rakukogum paistab mikroskoobi all ühe rakuna, kuid tegelikult koosneb mitmest rakust, mistõttu näiv kontsentratsioon väheneb.
• Pipeti töövahemik. Pipeti kasutamine väljaspool selle ettenähtud ruumalavahemikku annab ebatäpseid tulemusi. 1000 μL pipett, mis on seadistatud väljastama 5 μL, ei ole usaldusväärne; selle asemel tuleb kasutada väiksemat pipetti.
• Ühikuvead. Ühikute rakku/ml ja rakku/μL segiajamine tekitab tuhat korda liiga suure või liiga väikese vea.
• Surnud rakud. Toores rakuloendus sisaldab surnud rakke, kui ei kasutatud eluvõime värvingut, näiteks trüpaansinist. Seetõttu võib tegelikult elus olevate rakkude arv olla üle hinnatud.

Selle kalkulaatori piirangud

Kalkulaator lükkab tagasi arvud, mille põhjal ei saa anda kasulikku vastust:

• Kõik väärtused peavad olema suuremad kui null.
• Sihtkontsentratsioon ei tohi olla suurem kui algkontsentratsioon.
• Algkontsentratsioon peab olema 1 triljonit rakku/ml (1 × 10¹²) või vähem.
• Arvutatud varususpensiooni ruumala peab olema vähemalt 0,001 mL ehk 1 mikroliiter. Väiksemat kogust ei saa täpselt pipeteerida, seega palub kalkulaator sisestada teistsugused arvud. Tavaliselt lahendab probleemi kogu mahu suurendamine.

Ruumalad kuvatakse kahe kümnendkohani või kolme kümnendkohani, kui varususpensiooni ruumala on väiksem kui 0,01 mL, et väike ruumala ei kuvataks kujul 0,00 mL.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on rakkude lahjendamise valem?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, kus C₁ ja C₂ on alg- ja sihtkontsentratsioon ning V₁ ja V₂ on varususpensioonist võetud ruumala ja kogu lõppmaht.

Kas sihtkontsentratsioon võib olla suurem kui algkontsentratsioon?

Ei. Lahjendamine vähendab kontsentratsiooni. Suurema kontsentratsiooni saavutamiseks tuleb rakud tsentrifuugida ja suspendeerida need uuesti väiksemas ruumalas.

Millist vedelikku tuleks rakkude lahjendamiseks kasutada?

Täielikku rakukultuurikeskkonda kasutatakse siis, kui rakud peavad püsima elus tundide või päevade jooksul, näiteks enne plaadile külvamist. PBS või muu sarnane puhverdatud soolalahus sobib lühiajaliseks, alla ligikaudu 30 minuti pikkuseks lahjendamiseks, enne kui rakke edasi töödeldakse. Seerumivaba keskkonda kasutatakse siis, kui seerumivalgud segaksid järgnevat analüüsi.

Kas see valem sobib bakteritele või pärmile?

Jah. C₁V₁ = C₂V₂ kehtib igasuguse osakeste suspensiooni kohta, sealhulgas bakteritele, mida mõõdetakse kolooniaid moodustavates ühikutes milliliitri kohta (CFU/ml), pärmile ja viirusosakestele, mida mõõdetakse naastusid moodustavates ühikutes milliliitri kohta (PFU/ml), tingimusel et võrrandi mõlemal poolel kasutatakse samu ühikuid.

Kas surnud rakud tuleb lahjenduse arvutamisel arvesse võtta?

Eluskultuuri külvamisel tuleb arvesse võtta ainult eluvõimelisi rakke. Kui suspensiooni eluvõime on 80%, on selle eluvõimeliste rakkude kontsentratsioon 0,8 korda suurem kui kogurakkude loenduse põhjal saadud väärtus ning seda eluvõimeliste rakkude kontsentratsiooni tuleb kasutada väärtusena C₁.

Kuidas väga suuri lahjendusi täpselt valmistada?

Suuri lahjendusi, näiteks 1-osa-1000-st, tehakse tavaliselt mitme väiksema järjestikuse etapina, mida nimetatakse seerialahjendusteks. Kolm järjestikust 1-osa-10-st lahjendust annavad kokku 1-osa-1000-st lahjenduse, kusjuures iga pipeteerimisetapp jääb täpse töö jaoks sobivasse ruumalavahemikku.